Fetale Alkoholspektrumstörung – ist das eine Ziliopathie?

Hintergrund: Der Begriff „fetale Alkoholspektrumstörung“ (FASD) beschreibt ein breites Spektrum von entwicklungsneurologischen Erscheinungen, die sich aus einer Alkoholexposition in utero ergeben. Die Prävalenz wurde auf 1 von 100 Personen und auf mehr als 330.000 betroffene Personen in Kanada geschätzt. Die kanadischen Diagnoserichtlinien beschreiben die Auswirkungen auf die körperliche und neurologische Entwicklung, die sich aus einer pränatalen Alkoholexposition ergeben. Dazu gehören ausgeprägte Gesichtszüge, Mikrozephalie und neurologische Entwicklungsdefizite.

Die Ethanoltoxizität wird im Zusammenhang mit der Konzentration, Dauer und dem Zeitpunkt der Ethanolexposition und den möglichen Wegen untersucht, die zu einer phänotypischen Übersetzung in die Teratogenese führen. Studien von FASD in Tiermodellen beginnen, eine Reihe von Suszeptibilitätsgenen zu implizieren, die an verschiedenen molekularen Signalwegen von Gen-Ethanol-Wechselwirkungen beteiligt sind. Einige von ihnen sind Berichten zufolge an der Ethanol-Teratogenese als Teil ihrer Rolle bei der Kontrolle von DNA-Schäden, der Bildung der Achse des zentralen Nervensystems, dem zellulären Überleben sowie der Proliferation und dem Wachstum beteiligt.

Es ist bekannt, dass eine Mutation in einem bestimmten Gen, der neuronalen Stickoxidsynthase (nNOS)), den alkoholinduzierten neuronalen Tod sowohl in vivo als auch in vitro verschlimmert, und die Expression des nNOS-Gens schützt Neuronen vor Alkoholtoxizität. Stickoxid (NO) wird durch die synthetisiert Enzym Stickoxid-Synthase (NOS durch) L-Arginin Es gibt drei NOS-Isoformen: neuronale NOS (nNOS, NOS-1), induzierbare NOS (iNOS, NOS-2) und endotheliale NOS (eNOS, NOS-3). verbunden mit der Modulation der Neurotransmission und der Gedächtnisbildung zusammen mit anderen lebenswichtigen Aktivitäten. In Gegenwart von O2 bilden sich Radikale, die zu Toxizität führen können. Sie können zelluläre Signalprozesse stören und zu pathologischen Zuständen führen.

Daten deuten darauf hin, dass Ethanol die NOS-Expression und -Aktivität im Gehirn verändert. Es gibt bekannte Wirkungen von Ethanol auf die Produktion von NO, NOS-Aktivitäten und Wechselwirkungen von NO mit Enzymen des Alkoholstoffwechsels.

Dosis und Dauer der Ethanolexposition sind die Hauptfaktoren, die die Wirkungen von Ethanol auf die NO-Produktion, die NOS-Aktivität oder die NOS-Expression bestimmen.

Strukturelle angeborene Hirnanomalien werden im Zusammenhang mit FASD beschrieben, einschließlich Mikrozephalie, Migrationsanomalien, Neuralrohrdefekte, zusammen mit Anomalien der Mittellinie des Gehirns, die das Corpus Callosum, Kleinhirnanomalien und Hydrozephalus betreffen.

Zilien sind evolutionär konservierte antennenartige Organellen, die auf der Oberfläche von Zellen zu finden sind. Zilien erkennen verschiedene extrazelluläre Reize wie Flüssigkeitsfluss, Licht, Geruch und Hormone durch spezifische Ziliarrezeptoren und spielen eine Schlüsselrolle bei der Zellbewegung und -teilung, der Flüssigkeitsbewegung sowie der embryonalen Entwicklung verschiedener Gewebe. In Bezug auf die neurale Entwicklung wurde kürzlich gezeigt, dass Ziliarwachstumsfaktoren eine Rolle bei der Migration und Signalübertragung embryonaler neuronaler Zellen sowie bei der Bildung der Mittellinie und Lateralisierung des zentralen Nervensystems (ZNS) spielen. Im reifen Organismus erstrecken sich Zilien von den Basalkörpern der Ependymzellen, die die ventrikuläre Oberfläche des Gehirns auskleiden, wo sie den Fluss von Cerebro Spinal Fluid (CSF) erleichtern.

Defekte des Nervensystems sind stark mit einer Reihe von Ciliopathien verbunden, wobei häufige Befunde Mittelliniendefekte wie Hydrozephalus, Neuralrohrdefekte und eine Vielzahl von kortikalen und zerebellären Anomalien umfassen.

Der Prototyp einer menschlichen Ziliarerkrankung war die Primäre Ziliardyskinesie (PCD). In den letzten zehn Jahren haben bedeutende Fortschritte im Verständnis von PCD zu einer verbesserten Diagnose geführt, hauptsächlich durch die Erkenntnis, dass nasales Stickstoffmonoxid (nasales NO) bei diesen Patienten stark reduziert ist. Es wurde vermutet, dass der Mechanismus dieser Reduktion mit der reduzierten iNOs-Expression als Teil der Ziliopathie zusammenhängt. Die nasale NO-Messung ist ein einfacher, nicht-invasiver Test, der selbst bei den jüngsten Patienten problemlos durchgeführt werden kann.

Da die NO-Messung ein einfacher, nicht-invasiver Test mit sofortigen Ergebnissen ist, dient sie als idealer Screening-Test für die suggestive Diagnose verschiedener Ziliopathien, einschließlich solcher mit Hirnfehlbildungen.

In neueren Arbeiten war diese Forschungsgruppe die erste, die einen Zusammenhang zwischen Zilienfunktionsstörungen, gemessen anhand der nasalen NO-Konzentration, und isolierten Anomalien des Zentralnervensystems (ZNS) in der Mittellinie feststellte. war im Vergleich zum zuvor festgelegten Normalbereich signifikant niedriger, wobei einige im Bereich der primären Ziliendyskinesie (PCD) lagen. Jüngste Arbeiten zeigen, dass die interneuronale Konnektivität, die Morphogenese der Gehirnventrikel und die ordnungsgemäße Bildung des Neuralrohrs von einer nicht gestörten Ziliarfunktion abhängen.

Die Funktion der primären Zilien beruht auf Membranproteinen wie Polycystin-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 und Fibrocystin. Acetyliertes Alpha-Tubulin ist ein bekannter Ziliarmarker.

Veränderungen in PC-1 sind mit Typ-1-Mutationen der polyzystischen Nierenerkrankung assoziiert, die in Metabolom- und Lipidom-Tests mit Fettsäureoxidationsdefekten in Verbindung gebracht wurden. Acetyliertes Alpha-Tubulin wird durch proteinomische Analyse bewertet.

Hypothese: Angesichts der jüngsten Erkenntnis der Wechselwirkungen zwischen NO mit Ethanol und der wichtigen Rolle der Zilien in der frühen Gehirnentwicklung nehmen die Forscher an, dass Zilien an molekularen Signalwegen beteiligt sein könnten, die zu Hirnverletzungen bei Kindern führen, bei denen FASD diagnostiziert wurde. Ein solcher Mechanismus wurde bisher nicht untersucht.

Die Forscher gehen davon aus, dass die nasalen NO-Spiegel sowie die Schlüsselmetaboliten bei Patienten, bei denen FASD diagnostiziert wurde, im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen reduziert sind.

Ziel: Diese Studie zielt darauf ab, nasales NO in einer ausgewählten Gruppe von Patienten mit diagnostizierter fetaler Alkoholspektrumstörung zusammen mit Metabolomik- und Proteinomanalyse in Bezug auf Schlüsselmetaboliten zu messen, die am NO-Weg in Urinproben beteiligt sind, und sie mit gesunden Kindern zu vergleichen. Diese Studie wird Ärzte in die Lage versetzen, möglicherweise ein nicht-invasives Screening-Tool für pädiatrische Patienten mit Verdacht auf eine fetale Alkoholspektrumstörung einzusetzen und eine frühzeitige Intervention in der Entwicklung in Betracht zu ziehen.

Methoden: 10 Kinder im Alter von 5-16 Jahren, bei denen FASD diagnostiziert wurde, werden aus der FASD-Ambulanz des Glenrose Rehabilitation Hospital rekrutiert. 10 gesunde Kinder derselben Altersgruppe werden über das HICUPP-Register für gesunde Kinder (Pro00056156) rekrutiert.

Die Ermittler messen die nasalen NO-Spiegel, indem sie eine inerte NO-Probenahmeleitung mit einer Einweg-Schaumolive (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) in das Nasenloch des Kindes einführen, während das kontralaterale Nasenloch offen bleibt. Luftproben werden dann mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,3 Liter/min aus der Nase durch einen Chemilumineszenz-Analysator entnommen, der eine Messung des nasalen NO-Gehalts in Teilen pro Milliarde (ppb) liefert. Alle nasalen NO-Messungen werden bei sitzenden Probanden durchgeführt.

Die Messungen werden unter Verwendung eines NO-Analysators (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Dürten, Schweiz) erhalten. Der Analysator wird gemäß den Herstellerangaben kalibriert. Die Messungen werden unter Verwendung der Velum-Closing-Technik durch Ausatmen aus einer tiefen Inspiration durch einen festen Widerstand (Einweg-Kartonzylinder mit 1 mm Öffnung; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) für 20–40 Sekunden oder über ein Party-Bevorzugungs-Blowout-Spielzeug durchgeführt mit vergleichbarem Ausatemwiderstand. Beide Widerstandstypen erfordern ein leichtes Aufblähen der Wangen, um einen Munddruck > 5 cm H2O zu entwickeln, ein Druck, der ausreicht, um den weichen Gaumen zu schließen. Die Manöver werden gemäß den ATS/ERS-Richtlinien durchgeführt. Bei Patienten, die mit dem obigen Manöver nicht kooperativ sind, werden die Messungen unter Verwendung von Tidal-Atemproben durchgeführt.

Der Prüfer gibt den gemessenen NO-Gehalt direkt in eine Computerdatei ein, die in einem verschlüsselten Format auf einem passwortgeschützten Computer im Glenrose Rehabilitation Hospital gespeichert wird. Identifizierende Informationen wie Namen oder Telefonnummern der Teilnehmer werden nicht eingegeben. Jedem Teilnehmer wird anstelle eines Namens eine Nummer zugewiesen, die aufgezeichnet wird. Andere identifizierende Informationen wie Geschlecht, Alter und Diagnose des Kindes werden ebenfalls mit einer Nummer codiert.

Basierend auf den bereitgestellten Informationen wird eine statistische Analyse von Kovarianten durchgeführt, wobei die gemessenen NO-Werte von Patienten mit FASD mit gesunden Kontrollen verglichen werden (mit dem Referenzbereich des Normalwerts, wie in Mateo 2011 und Martin 2011 veröffentlicht).

Zusätzlich zu den nasalen NO-Messungen werden die Forscher auch metabolomische und proteomische Analysen durchführen, um die Konzentrationen von Schlüsselmetaboliten und Proteinen im Urin von Patienten mit FASD zu messen. Diese werden mit den gesunden Kontrollen verglichen, um diese Hypothese der Ziliarbeteiligung weiter zu untersuchen. Die Metabolomanalysen werden verwendet, um Schlüsselmetaboliten zu messen, die am NO-Weg beteiligt sind (Arginin, Citrullin, Ornithin, asymmetrisches Dimethylarginin) sowie lösliche NO-Nebenprodukte (Nitrotyrosin, Nitrotryptophan und 3-Nitro-4-hydroxyphenylessigsäure). Zusätzliche metabolomische Studien werden durchgeführt, um nach veränderten Beta-Oxidationsmarkern (Acylcarnitine) zu suchen, die durch Ziliarfunktionsstörungen, Vitaminspiegel (insbesondere Vitamin A und seine Nebenprodukte) sowie Veränderungen der Katecholamine (aufgrund veränderter neuronaler Funktionen, die durch Zilien beeinflusst werden) im Urin. Die Metabolomanalysen werden mit gezielten, MS-basierten Metabolomics-Methoden durchgeführt. Die Forscher werden auch proteomische Analysen des Urins von FASD-Patienten durchführen, um Veränderungen der wichtigsten Ziliarproteine, nämlich Polycystin-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, Fibrocystin) sowie acetyliertes Alpha-Tubulin, zu messen und diese zu vergleichen Werte für eine Gruppe gesunder Kinder. Die Proteomikanalysen bestehen aus einer Kombination aus MS-basierter Proteomik und Immunoassays.

Die Daten werden mit PASW Statistics Version 19 (SPSS Inc., 2010) analysiert. Alpha wird für alle Analysen auf 0,05 gesetzt. Der Prozentsatz der Kinder, die bei jeder Messung über und unter den alters- und normbasierten Grenzwerten liegen, wird berechnet.

Um zu bestimmen, ob sich die beiden Gruppen (FASD, gesunde Kontrollen) im gemessenen Niveau unterscheiden, wird eine multivariate Varianzanalyse (MANOVA) an Subskalenwerten durchgeführt, wobei die Gruppe als Zwischensubjektfaktor verwendet wird.

Da die Stichprobengröße klein ist, werden die Forscher eine Effektgröße zwischen den Gruppen für den NO-Gehalt und die Metabolomik-Analyse sowie ein 95-%-Konfidenzintervall für die Effektgröße angeben. Die Hypothese ist, dass es einen Unterschied zwischen den Gruppen gibt; Da die Ermittler die Null nicht beweisen können (d. h. das Fehlen eines statistisch signifikanten Befunds beweist die Hypothese nicht), werden die Ermittler diese Effektgröße verwenden, um stattdessen den Effekt zu schätzen. Es wird jedoch die Hypothese aufgestellt, dass die nasalen NO-Spiegel und Schlüsselmetaboliten in Bezug auf NO bei Kindern mit FASD im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen reduziert sind.

Nach Abschluss der Studie werden die anonymisierten Daten für mindestens fünf Jahre in einer verschlüsselten Datei auf dem passwortgeschützten Computer aufbewahrt.