Foetale alcoholspectrumstoornis - is dit een ciliopathie?

Achtergrond: De term "foetale alcoholspectrumstoornis" (FASD) beschrijft een breed spectrum van neurologische ontwikkelingsstoornissen als gevolg van blootstelling aan alcohol in de baarmoeder. De prevalentie wordt geschat op 1 op de 100 mensen en wordt geschat op meer dan 330.000 getroffen personen in Canada. De Canadian Diagnostic Guidelines beschrijven de fysieke en neurologische ontwikkelingseffecten als gevolg van prenatale blootstelling aan alcohol. Deze omvatten verschillende gelaatstrekken, microcefalie en neurologische ontwikkelingsstoornissen.

Ethanoltoxiciteit wordt onderzocht in samenhang met de concentratie, duur en timing van blootstelling aan ethanol en de mogelijke routes die leiden tot fenotypische vertaling naar teratogenese. Studies van FASD in diermodellen beginnen een aantal gevoeligheidsgenen te impliceren die betrokken zijn bij verschillende moleculaire routes op gen-ethanol-interacties. Sommige daarvan zijn naar verluidt betrokken bij de teratogenese van ethanol als onderdeel van hun rol bij de controle van DNA-schade, de vorming van de as van het centrale zenuwstelsel, cellulaire overleving en proliferatie en groei.

Van een mutatie in een bepaald gen, neuronale stikstofoxidesynthase (nNOS) is bekend dat deze door alcohol geïnduceerde neuronale dood verergert, zowel in vivo als in vitro, en expressie van het nNOS-gen beschermt neuronen tegen alcoholtoxiciteit Stikstofmonoxide (NO) wordt gesynthetiseerd door de enzym stikstofoxidesynthase (NOS tot en met) L-arginine Er zijn drie NOS-isovormen: neuronale NOS (nNOS, NOS-1), induceerbare NOS (iNOS, NOS-2) en endotheliale NOS (eNOS, NOS-3). geassocieerd met modulatie van neurotransmissie en geheugenvorming samen met andere vitale activiteiten. In aanwezigheid van O2 vormen zich radicalen die tot toxiciteit kunnen leiden. Ze kunnen celsignaleringsprocessen verstoren en leiden tot pathologische aandoeningen.

Gegevens suggereren dat ethanol de NOS-expressie en -activiteit in de hersenen verandert. Er zijn bekende effecten van ethanol op de productie van NO, NOS-activiteiten en interacties van NO met alcoholmetabolisme-enzymen.

Dosis en duur van blootstelling aan ethanol zijn de belangrijkste factoren die de effecten van ethanol op NO-productie, NOS-activiteit of NOS-expressie bepalen.

Structurele aangeboren hersenafwijkingen worden beschreven in de context van FASD, waaronder microcefalie, migratieafwijkingen, neurale buisdefecten samen met middellijn hersenafwijkingen waarbij het corpus callosum betrokken is, cerebellaire afwijkingen en hydrocephalus.

Cilia zijn evolutionair geconserveerde antenne-achtige organellen die op het oppervlak van cellen worden aangetroffen. Cilia detecteren verschillende extracellulaire stimuli zoals vloeistofstroom, licht, geur en hormonen via specifieke ciliaire receptoren, en ze spelen een sleutelrol bij de voortbeweging en deling van cellen, vloeistofbeweging, evenals de embryonale ontwikkeling van verschillende weefsels. Met betrekking tot neurale ontwikkeling is onlangs aangetoond dat ciliaire groeifactoren een rol spelen bij de migratie en signalering van embryonale neuronale cellen, evenals bij de vorming van de middellijn en lateralisatie van het centrale zenuwstelsel (CZS). In het volwassen organisme strekken cilia zich uit van de basale lichamen van de ependymale cellen die het ventriculaire oppervlak van de hersenen bekleden, waar ze de stroom van cerebrospinale vloeistof (CSF) vergemakkelijken.

Zenuwstelseldefecten zijn sterk geassocieerd met een aantal ciliopathieën, met gemeenschappelijke bevindingen waaronder middellijndefecten zoals hydrocephalus, neurale buisdefecten en een overvloed aan corticale en cerebellaire afwijkingen.

Het prototype van de menselijke ciliaire ziekte was primaire ciliaire dyskinesie (PCD). In het afgelopen decennium heeft een aanzienlijke vooruitgang in het begrip van PCD geleid tot een verbeterde diagnose, voornamelijk door de bevinding dat nasale stikstofmonoxide (nasale NO) bij deze patiënten sterk is verminderd. Er is gesuggereerd dat het mechanisme van deze reductie verband houdt met verminderde iNOs-expressie als onderdeel van de ciliopathie. Neus-NO-meting is een eenvoudige, niet-invasieve test die gemakkelijk kan worden uitgevoerd, zelfs bij de jongste patiënten.

Aangezien NO-meting een eenvoudige, niet-invasieve test is met onmiddellijke resultaten, dient het als een ideale screeningstest voor suggestieve diagnose van verschillende ciliopathieën, waaronder die met misvormingen van de hersenen.

In recent werk was deze onderzoeksgroep de eerste die een verband vaststelde tussen ciliaire disfunctie zoals gemeten door nasale NO-concentratie en geïsoleerde anomalieën van het centrale zenuwstelsel (CZS) in de middellijn. was significant lager in vergelijking met het eerder vastgestelde normale bereik, waarbij sommige binnen het bereik van primaire ciliaire dyskinesie (PCD) vielen. Recent werk toont aan dat interneuronale connectiviteit, morfogenese van de hersenventrikels en de juiste vorming van de neurale buis afhangen van een niet-verstoorde ciliaire functie.

De primaire cilia-functie als gevolg van membraaneiwitten zoals polycystine-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 en fibrocystine. Geacetyleerd alfa-tubuline is een bekende ciliaire marker.

Veranderingen in PC-1 worden geassocieerd met polycysteuze nierziekte type 1-mutaties waarvan werd vastgesteld dat ze verband hielden met vetzuuroxidatiedefecten in metabolomische en lipidomische tests. Geacetyleerd alfa-tubuline wordt beoordeeld door middel van proteïnoomanalyse.

Hypothese: Gezien de recente erkenning van de interacties tussen NO met ethanol en de belangrijke rol van cilia in de vroege hersenontwikkeling, veronderstellen de onderzoekers dat cilia mogelijk betrokken zijn bij moleculaire routes die leiden tot hersenletsel bij kinderen met de diagnose FASD. Een dergelijk mechanisme is nog niet eerder onderzocht.

De onderzoekers veronderstellen dat de nasale NO-niveaus en de belangrijkste metabolieten bij patiënten met de diagnose FASD zullen worden verlaagd in vergelijking met gezonde controles.

Doelstelling: Deze studie zal gericht zijn op het meten van nasale NO bij een geselecteerde groep patiënten met de diagnose foetaal alcoholspectrumstoornis, samen met metabolomics en proteïnomische analyse in verband met de belangrijkste metabolieten die betrokken zijn bij de NO-route in urinemonsters, en deze vergelijken met gezonde kinderen. Deze studie stelt clinici in staat om mogelijk een niet-invasieve screeningstool te gebruiken voor pediatrische patiënten met vermoedelijke foetale alcoholspectrumstoornis en een vroege ontwikkelingsinterventie te overwegen.

Methoden: 10 kinderen in de leeftijd van 5-16 jaar, bij wie de diagnose FASD is gesteld, worden gerekruteerd uit de FASD-polikliniek van het Glenrose Rehabilitation Hospital. 10 gezonde kinderen van dezelfde leeftijdscategorie zullen worden geworven via het HICUPP-register voor gezonde kinderen (Pro00056156).

De onderzoekers zullen de nasale NO-niveaus meten door een inerte NO-bemonsteringslijn met een wegwerpbare schuimrubberen olijf (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) in het neusgat van het kind te steken terwijl het contralaterale neusgat open blijft. Lucht wordt vervolgens met een constante snelheid van 0,3 liter/min uit de neus bemonsterd door een chemiluminescente analysator die het NO-gehalte in de neus meet in delen per miljard (ppb). Alle nasale NO-metingen worden uitgevoerd terwijl de proefpersonen zitten.

Metingen worden verkregen met behulp van een NO-analysator (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Zwitserland). De analysator wordt gekalibreerd volgens de specificaties van de fabrikant. Metingen worden uitgevoerd met behulp van velum-sluitingstechniek via uitademing van een diepe inspiratie door een vaste weerstand (wegwerpbare, kartonnen cilinder met opening van 1 mm; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) gedurende 20-40 seconden of via een uitblaasspeeltje voor een feestje met een vergelijkbare uitademingsweerstand. Beide soorten weerstand vereisen een lichte opbolling van de wangen om een ​​monddruk > 5 cm H2O te ontwikkelen, een druk die voldoende is om het zachte gehemelte te sluiten. De manoeuvres worden uitgevoerd volgens de ATS/ERS-richtlijnen. Bij patiënten die niet meewerken aan de bovenstaande manoeuvre, worden de metingen uitgevoerd met behulp van getijde-ademmonsters.

De onderzoeker voert het gemeten NO-niveau rechtstreeks in een computerbestand in, dat versleuteld wordt opgeslagen op een met een wachtwoord beveiligde computer in het Glenrose Rehabilitation Hospital. Identificatiegegevens zoals namen of telefoonnummers van deelnemers worden niet ingevoerd. Elke deelnemer krijgt een nummer toegewezen in plaats van een naam, die wordt opgenomen. Andere identificerende informatie, zoals het geslacht, de leeftijd en de diagnose van het kind, wordt ook gecodeerd met een nummer.

Op basis van de verstrekte informatie zal een statistische analyse van co-varianten worden uitgevoerd, waarbij de gemeten NO-niveaus van patiënten met FASD worden vergeleken met gezonde controles (met het referentiebereik van de normaal zoals gepubliceerd in Mateo 2011 en Martin 2011).

Naast de nasale NO-metingen zullen de onderzoekers ook metabolomische en proteomische analyses uitvoeren om de niveaus van belangrijke metabolieten en eiwitten in de urine van patiënten met FASD te meten. Deze zullen worden vergeleken met de gezonde controles om deze hypothese van ciliaire betrokkenheid verder te onderzoeken. De metabolomische analyses zullen worden gebruikt om de belangrijkste metabolieten te meten die betrokken zijn bij de NO-route (arginine, citrulline, ornithine, asymmetrische dimethylarginine) evenals oplosbare NO-bijproducten (nitrotyrosine, nitrotryptofaan en 3-nitro-4-hydroxyfenylazijnzuur). Aanvullende metabolomische studies zullen worden uitgevoerd om te zoeken naar gewijzigde bèta-oxidatiemarkers (acylcarnitines) die kunnen worden beïnvloed door ciliaire disfunctie, vitamineniveaus (vooral vitamine A en zijn bijproducten) evenals veranderingen in catecholamines (als gevolg van veranderde neuronale functies beïnvloed door cilia) in de urine. De metabolomics-analyses zullen worden uitgevoerd met behulp van gerichte, op MS gebaseerde metabolomics-methoden. De onderzoekers zullen ook proteoomanalyse uitvoeren op urine bij FASD-patiënten om veranderingen in belangrijke ciliaire eiwitten, namelijk polycystine-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocystine) en geacetyleerd alfa-tubuline te meten en deze te vergelijken waarden voor een groep gezonde kinderen. De proteoomanalyses zullen bestaan ​​uit een combinatie van op MS gebaseerde proteomica en immunoassays.

De gegevens worden geanalyseerd met behulp van PASW Statistics Version 19 (SPSS Inc., 2010). Alpha wordt voor alle analyses op .05 gezet. Per meting wordt het percentage kinderen berekend dat boven- en onder de leeftijd scoort en op norm gebaseerde afkapwaarden.

Om te bepalen of de twee groepen (FASD, gezonde controles) verschillen in het gemeten niveau, zal een Multivariate Variantieanalyse (MANOVA) worden uitgevoerd op subschaalscores met Groep als een factor tussen proefpersonen.

Aangezien de steekproefomvang klein is, zullen de onderzoekers een effectgrootte rapporteren tussen de groepen voor het NO-niveau en de metabolomics-analyse, evenals een betrouwbaarheidsinterval van 95% voor de effectgrootte. De hypothese is dat er een verschil is tussen de groepen; aangezien de onderzoekers de nul niet kunnen bewijzen (d.w.z. het ontbreken van een statistisch significante bevinding zal de hypothese niet bewijzen), zullen de onderzoekers deze effectgrootte gebruiken om in plaats daarvan het effect te schatten. Er wordt echter verondersteld dat de nasale NO-niveaus en de belangrijkste metabolieten met betrekking tot NO bij kinderen met FASD verlaagd zullen zijn in vergelijking met gezonde controles.

Na afronding van het onderzoek worden de geanonimiseerde gegevens minimaal vijf jaar in een versleuteld bestand op de met een wachtwoord beveiligde computer bewaard.