Trastorno del espectro alcohólico fetal: ¿es esto una ciliopatía?

Antecedentes: el término "trastorno del espectro alcohólico fetal" (FASD, por sus siglas en inglés) describe un amplio espectro de presentaciones del neurodesarrollo que resultan de la exposición al alcohol en el útero. La prevalencia se ha estimado en 1 de cada 100 personas, y se estima en más de 330 000 personas afectadas en Canadá. Las Directrices de diagnóstico canadienses describen los efectos físicos y de desarrollo neurológico resultantes de la exposición prenatal al alcohol. Estos incluyen rasgos faciales distintivos, microcefalia y deficiencias en el desarrollo neurológico.

La toxicidad del etanol se investiga en asociación con la concentración, la duración y el momento de la exposición al etanol y las posibles vías que conducen a la traducción fenotípica a la teratogénesis. Los estudios de FASD en modelos animales están comenzando a implicar una serie de genes de susceptibilidad que están involucrados en varias vías moleculares en las interacciones entre genes y etanol. Algunos de los cuales, según se informa, están involucrados en la teratogénesis del etanol como parte de sus funciones en el control de daños en el ADN, la formación del eje del sistema nervioso central, la supervivencia celular, así como la proliferación y el crecimiento.

Se sabe que una mutación en un gen particular, la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) empeora la muerte neuronal inducida por el alcohol tanto in vivo como in vitro, y la expresión del gen nNOS protege a las neuronas contra la toxicidad del alcohol. El óxido nítrico (NO) es sintetizado por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS hasta) L-arginina Hay tres isoformas de NOS: NOS neuronal (nNOS, NOS-1), NOS inducible (iNOS, NOS-2) y NOS endotelial (eNOS, NOS-3). asociado con la modulación de la neurotransmisión y la formación de la memoria junto con otras actividades vitales. En presencia de O2, se forman radicales que pueden provocar toxicidad. Pueden ser perjudiciales para los procesos de señalización celular y dar lugar a condiciones patológicas.

Los datos sugieren que el etanol altera la expresión y la actividad de la NOS en el cerebro. Se conocen los efectos del etanol sobre la producción de NO, las actividades de la NOS y las interacciones del NO con las enzimas del metabolismo del alcohol.

La dosis y la duración de la exposición al etanol son los principales factores que determinan los efectos del etanol sobre la producción de NO, la actividad de la NOS o la expresión de la NOS.

Las anomalías cerebrales congénitas estructurales se describen en el contexto de los trastornos del espectro alcohólico fetal, incluidas la microcefalia, anomalías de migración, defectos del tubo neural junto con anomalías cerebrales de la línea media que afectan al cuerpo calloso, anomalías cerebelosas e hidrocefalia.

Los cilios son orgánulos similares a antenas conservados evolutivamente que se encuentran en la superficie de las células. Los cilios detectan diferentes estímulos extracelulares, como el flujo de fluidos, la luz, el olor y las hormonas a través de receptores ciliares específicos, y desempeñan un papel clave en la locomoción y división celular, el movimiento de fluidos y el desarrollo embrionario de diferentes tejidos. En lo que respecta al desarrollo neuronal, recientemente se demostró que los factores de crecimiento ciliar desempeñan un papel en la migración y señalización de células neuronales embrionarias, así como en la formación de la línea media y la lateralización del Sistema Nervioso Central (SNC). En el organismo maduro, los cilios se extienden desde los cuerpos basales de las células ependimarias que recubren la superficie ventricular del cerebro, donde facilitan el flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR).

Los defectos del sistema nervioso están fuertemente asociados con una serie de ciliopatías, con hallazgos comunes que incluyen defectos de la línea media como hidrocefalia, defectos del tubo neural y una plétora de anomalías corticales y cerebelosas.

El prototipo de enfermedad ciliar humana ha sido la discinesia ciliar primaria (PCD). En la última década, un avance significativo en la comprensión de la PCD ha llevado a un mejor diagnóstico, principalmente por el hallazgo de que el óxido nítrico nasal (NO nasal) está muy reducido en estos pacientes. Se ha sugerido que el mecanismo de esta reducción está relacionado con la expresión reducida de iNO como parte de la ciliopatía. La medición de NO nasal es una prueba simple no invasiva que se realiza fácilmente incluso en los pacientes más jóvenes.

Dado que la medición de NO es una prueba simple no invasiva con resultados inmediatos, sirve como una prueba de detección ideal para el diagnóstico sugestivo de varias ciliopatías, incluidas aquellas que involucran malformaciones cerebrales.

En un trabajo reciente, este grupo de investigación fue el primero en determinar una conexión entre la disfunción ciliar medida por la concentración de NO nasal y las anomalías aisladas del sistema nervioso central (SNC) en la línea media. fue significativamente más bajo en comparación con el rango normal previamente establecido, y algunos estaban dentro del rango de Discinesia ciliar primaria (PCD). Trabajos recientes muestran que la conectividad interneuronal, la morfogénesis de los ventrículos cerebrales y la formación adecuada del tubo neural dependen de una función ciliar no alterada.

Los cilios primarios funcionan como resultado de proteínas de membrana como policistina-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 y fibrocistina. La tubulina alfa acetilada es un marcador ciliar conocido.

Las alteraciones en PC-1 están asociadas con mutaciones de la enfermedad renal poliquística tipo 1 que se encontró que estaban asociadas con defectos de oxidación de ácidos grasos en pruebas metabolómicas y lipidómicas. La tubulina alfa acetilada se evalúa mediante análisis proteinómico.

Hipótesis: dado el reciente reconocimiento de las interacciones entre el NO y el etanol y el importante papel de los cilios en el desarrollo temprano del cerebro, los investigadores plantean la hipótesis de que los cilios pueden estar involucrados en las vías moleculares que conducen a lesiones cerebrales en niños diagnosticados con TEAF. Tal mecanismo no ha sido explorado previamente.

Los investigadores plantean la hipótesis de que los niveles nasales de NO, así como los metabolitos clave en pacientes diagnosticados con TEAF, se reducirán en comparación con los controles sanos.

Objetivo: Este estudio tendrá como objetivo medir el NO nasal en un grupo seleccionado de pacientes diagnosticados con Trastorno del Espectro Alcohólico Fetal, junto con análisis metabolómicos y proteinómicos en relación con los metabolitos clave involucrados en la vía del NO en muestras de orina, y compararlos con niños sanos. Este estudio permitirá a los médicos emplear potencialmente una herramienta de detección no invasiva para pacientes pediátricos con sospecha de trastorno del espectro alcohólico fetal y considerar una intervención temprana del desarrollo.

Métodos: Se reclutarán 10 niños de 5 a 16 años de edad a quienes se les haya diagnosticado FASD de la clínica para pacientes ambulatorios de FASD en el Hospital de Rehabilitación de Glenrose. Se reclutarán 10 niños sanos del mismo rango de edad a través del registro HICUPP para niños sanos (Pro00056156).

Los investigadores medirán los niveles nasales de NO insertando una línea de muestreo de NO inerte con una oliva de espuma desechable (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) en la fosa nasal del niño mientras la fosa nasal contralateral se deja abierta. Luego se muestreará el aire a una velocidad constante de 0,3 litros/min desde la nariz mediante un analizador quimioluminiscente que proporciona la medición del nivel nasal de NO en partes por billón (ppb). Todas las mediciones nasales de NO se realizarán con los sujetos sentados.

Las mediciones se obtendrán utilizando un analizador de NO (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Suiza). El analizador se calibrará de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las mediciones se realizarán mediante la técnica de cierre del velo a través de la exhalación de una inspiración profunda a través de una resistencia fija (cilindro de cartón desechable con una abertura de 1 mm; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) durante 20 a 40 segundos o mediante un juguete de fiesta. con una resistencia espiratoria comparable. Ambos tipos de resistencia requieren un ligero inflado de las mejillas para desarrollar una presión en la boca > 5 cm H2O, una presión suficiente para cerrar el velo del paladar. Las maniobras se realizarán de acuerdo con las directrices ATS/ERS. En los pacientes que no cooperen con la maniobra anterior, las mediciones se realizarán utilizando muestras de respiración tidal.

El examinador ingresará el nivel de NO medido directamente en un archivo de computadora, que se guardará en un formato encriptado en una computadora protegida con contraseña en el Hospital de Rehabilitación de Glenrose. No se ingresará información de identificación como nombres o números de teléfono de los participantes. A cada participante se le asignará un número en lugar de un nombre, que será grabado. Otra información de identificación, como el sexo, la edad y el diagnóstico del niño, también se codificará con un número.

Con base en la información proporcionada, se realizará un análisis estadístico de covariantes, comparando los niveles medidos de NO de pacientes con TEAF con controles sanos (con el rango de referencia de lo normal publicado en Mateo 2011 y Marthin 2011).

Además de las mediciones nasales de NO, los investigadores también realizarán análisis metabolómicos y proteómicos para medir los niveles de metabolitos y proteínas clave en la orina de pacientes con TEAF. Estos se compararán con los controles sanos para explorar más a fondo esta hipótesis de participación ciliar. Los análisis metabolómicos se utilizarán para medir los metabolitos clave implicados en la vía del NO (arginina, citrulina, ornitina, dimetilarginina asimétrica), así como los subproductos solubles del NO (nitrotirosina, nitrotriptófano y ácido 3-nitro-4-hidroxifenilacético). Se realizarán estudios metabolómicos adicionales para buscar marcadores de oxidación beta alterados (acilcarnitinas) que pueden verse afectados por la disfunción ciliar, los niveles de vitaminas (esp. vitamina A y sus derivados) así como cambios en las catecolaminas (debido a la alteración de las funciones neuronales afectadas por los cilios) en la orina. Los análisis metabolómicos se realizarán utilizando métodos metabolómicos específicos basados ​​en MS. Los investigadores también realizarán análisis proteómicos en orina en pacientes con TEAF para medir cambios en proteínas ciliares clave, a saber, policistina-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocistina), así como alfa-tubulina acetilada y comparar estos valores a un grupo de niños sanos. Los análisis proteómicos consistirán en una combinación de inmunoensayos y proteómicos basados ​​en MS.

Los datos se analizarán utilizando PASW Statistics Versión 19 (SPSS Inc., 2010). Alpha se establecerá en .05 para todos los análisis. Se calculará el porcentaje de niños que obtienen puntajes por encima y por debajo de la edad y los valores de corte basados ​​en normas en cada medición.

Para determinar si los dos grupos (FASD, controles sanos) difieren en el nivel medido, se realizará un análisis de varianza multivariado (MANOVA) en las puntuaciones de las subescalas utilizando el grupo como factor entre sujetos.

Teniendo en cuenta que el tamaño de la muestra es pequeño, los investigadores informarán un tamaño del efecto entre los grupos para el nivel de NO y el análisis metabolómico, así como un intervalo de confianza del 95 % para el tamaño del efecto. La hipótesis es que hay una diferencia entre los grupos; dado que los investigadores no pueden probar el valor nulo (es decir, la falta de un hallazgo estadísticamente significativo no probará la hipótesis), los investigadores utilizarán este tamaño del efecto para estimar el efecto. Sin embargo, existe la hipótesis de que los niveles nasales de NO y los metabolitos clave en relación con el NO en niños con TEAF se reducirán en comparación con los controles sanos.

Después de completar el estudio, los datos desidentificados se mantendrán en un archivo cifrado en la computadora protegida con contraseña durante un mínimo de cinco años.