Føtal alkoholspektrumforstyrrelse - er dette en ciliopati?

Baggrund: Udtrykket "føtal alkoholspektrumforstyrrelse" (FASD) beskriver et bredt spektrum af neuroudviklingsmæssige præsentationer som følge af alkoholeksponering in utero. Prævalensen er blevet anslået til 1 ud af 100 mennesker og anslået til at være mere end 330 000 berørte individer i Canada. De canadiske diagnostiske retningslinjer beskriver de fysiske og neuroudviklingsmæssige virkninger som følge af prænatal alkoholeksponering. Disse omfatter distinkte ansigtstræk, mikrocefali og neuroudviklingsmæssige mangler.

Ethanoltoksicitet forskes i forbindelse med koncentrationen, varigheden og timingen af ​​ethanoleksponering og de mulige veje, der fører til fænotypisk translation til teratogenese. Studier af FASD i dyremodeller begynder at implicere en række følsomhedsgener, der er involveret i forskellige molekylære veje på gen-ethanol-interaktioner. Nogle af dem er angiveligt involveret i ethanol-teratogenese som en del af deres roller i DNA-skadekontrol, dannelse af centralnervesystemets akse, cellulær overlevelse samt spredning og vækst.

En mutation i et bestemt gen, neuronal nitrogenoxidsyntase (nNOS)) vides at forværre alkoholinduceret neuronal død både in vivo og in vitro, og ekspression af nNOS-genet beskytter neuroner mod alkoholtoksicitet Nitrogenoxid (NO) syntetiseres af enzym nitrogenoxidsyntase (NOS gennem) L-arginin Der er tre NOS-isoformer: neuronal NOS (nNOS, NOS-1), inducerbar NOS (iNOS, NOS-2) og endotelial NOS (eNOS, NOS-3) .NO er forbundet med modulering af neurotransmission og hukommelsesdannelse sammen med andre vitale aktiviteter. I nærvær af O2 dannes der radikaler, der kan føre til toksicitet. De kan være forstyrrende for cellesignaleringsprocesser og resultere i patologiske tilstande.

Data tyder på, at ethanol ændrer NOS-ekspression og aktivitet i hjernen. Der er kendte effekter af ethanol på produktion af NO, NOS-aktiviteter og interaktioner af NO med alkoholmetabolismeenzymer.

Dosis og længden af ​​ethanoleksponering er de vigtigste faktorer, der bestemmer ethanoleffekter på NO-produktion, NOS-aktivitet eller NOS-ekspression.

Strukturelle medfødte hjerneanomalier beskrives i sammenhæng med FASD, herunder mikrocefali, migrationsanomalier, neuralrørsdefekter sammen med midtlinjeanomalier i hjernen, der involverer corpus callosum, cerebellare anomalier og hydrocephalus.

Cilia er evolutionært bevarede antennelignende organeller fundet på overfladen af ​​celler. Cilia detekterer forskellige ekstracellulære stimuli såsom væskeflow, lys, lugt og hormoner gennem specifikke ciliære receptorer, og de spiller nøgleroller i cellebevægelse og -deling, væskebevægelse samt embryonal udvikling af forskellige væv. Med hensyn til neural udvikling har ciliære vækstfaktorer for nylig vist sig at spille en rolle i embryonal neuronal cellemigration og signalering såvel som i dannelsen af ​​centralnervesystemets (CNS) midtlinje og lateralisering. I den modne organisme strækker cilia sig fra de basale kroppe af de ependymale celler, der beklæder den ventrikulære overflade af hjernen, hvor de letter strømmen af ​​Cerebro Spinal Fluid (CSF).

Defekter i nervesystemet er stærkt forbundet med en række ciliopatier, med almindelige fund, herunder midtlinjedefekter såsom hydrocephalus, neuralrørsdefekter og en overflod af kortikale og cerebellare abnormiteter.

Prototypen af ​​human ciliær sygdom har været primær ciliær dyskinesi (PCD). I det sidste årti har betydelige fremskridt i forståelsen af ​​PCD ført til forbedret diagnose, hovedsageligt ved at konstatere, at nasal nitrogenoxid (nasal NO) er stærkt reduceret hos disse patienter. Mekanismen for denne reduktion er blevet foreslået at være relateret til reduceret iNOs-ekspression som en del af ciliopatien. Nasal NO-måling er en simpel ikke-invasiv test, der let kan udføres selv hos de yngste patienter.

Da NO-måling er en simpel ikke-invasiv test med øjeblikkelige resultater, fungerer den som en ideel screeningstest til suggestiv diagnose af forskellige ciliopatier, herunder dem, der involverer hjernemisdannelser.

I nyere arbejde var denne forskergruppe den første til at bestemme en sammenhæng mellem ciliær dysfunktion målt ved nasal NO-koncentration og isolerede midtlinje-anomalier i centralnervesystemet (CNS) Det samlede gennemsnitlige NO-niveau i næsen hos børn med isolerede midtlinje-CNS-anomalier i undersøgelsen, var signifikant lavere sammenlignet med det tidligere etablerede normalområde, hvor nogle lå inden for området for primær ciliær dyskinesi (PCD). Nyligt arbejde viser, at inter neuronal forbindelse, hjerneventriklers morfogenese og korrekt dannelse af neuralrøret afhænger af ikke-afbrudt ciliær funktion.

De primære cilia fungerer som et resultat af membranproteiner såsom polycystin-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 og fibrocystin. Acetyleret alfa-tubulin er en kendt ciliær markør.

Ændringer i PC-1 er forbundet med polycystisk nyresygdom type 1 mutationer, der blev fundet at være forbundet med fedtsyreoxidationsdefekter i metabolomiske og lipidomiske tests. Acetyleret alfa-tubulin vurderes gennem proteinomisk analyse.

Hypotese: I betragtning af den nylige erkendelse af interaktionerne mellem NO med ethanol og den vigtige rolle, cilia spiller i tidlig hjerneudvikling, antager forskerne, at cilia kan være involveret i molekylære veje, der fører til hjerneskade hos børn, der er diagnosticeret med FASD. En sådan mekanisme er ikke tidligere blevet undersøgt.

Efterforskerne antager, at nasale NO-niveauer såvel som de vigtigste metabolitter hos patienter diagnosticeret med FASD vil blive reduceret sammenlignet med raske kontroller.

Formål: Denne undersøgelse vil sigte mod at måle nasal NO i en udvalgt gruppe patienter diagnosticeret med føtal alkoholspektrumforstyrrelse, sammen med metabolomik og proteinomisk analyse relateret til nøglemetabolitter involveret i NO-vejen i urinprøver, og sammenligne dem med raske børn. Denne undersøgelse vil gøre det muligt for klinikere potentielt at anvende et ikke-invasivt screeningsværktøj til pædiatriske patienter med mistanke om føtal alkoholspektrumforstyrrelse og overveje en tidlig udviklingsintervention.

Metoder: 10 børn i alderen 5-16 år, som er diagnosticeret med FASD, vil blive rekrutteret fra FASD ambulatoriet på Glenrose Rehabilitation Hospital. 10 raske børn i samme aldersgruppe vil blive rekrutteret gennem HICUPP-registret for raske børn (Pro00056156).

Efterforskerne vil måle nosale NO-niveauer ved at indsætte en inert NO-prøveslange med en engangs skumoliven (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) i barnets næsebor, mens det kontralaterale næsebor efterlades åbent. Derefter udtages luftprøver med en konstant hastighed på 0,3 liter/min. fra næsen af ​​en kemiluminescerende analysator, som giver måling af det nasale NO-niveau i dele pr. milliard (ppb). Alle nasale NO-målinger vil blive udført med forsøgspersonerne siddende.

Målinger vil blive opnået ved hjælp af en NO-analysator (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Schweiz). Analysatoren vil blive kalibreret i henhold til producentens specifikationer. Målingerne vil blive foretaget ved hjælp af velum-lukningsteknik via udånding fra en dyb inspiration gennem en fast modstand (engangs, papcylinder med 1 mm åbning; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) i 20-40 sekunder eller via et festlegetøj. med en sammenlignelig udåndingsmodstand. Begge typer modstande kræver let pust i kinderne for at udvikle et mundtryk > 5 cm H2O, et tryk tilstrækkeligt til at lukke den bløde gane. Manøvrerne vil blive udført i henhold til ATS/ERS retningslinjer. Hos patienter, som ikke samarbejder med ovenstående manøvre, vil målingerne blive foretaget ved hjælp af tidal breath sampling.

Undersøgeren vil indtaste det målte NO-niveau direkte i en computerfil, som vil blive gemt i et krypteret format på en adgangskodebeskyttet computer på Glenrose Rehabilitation Hospital. Identificerende oplysninger såsom deltagernes navne eller telefonnumre vil ikke blive indtastet. Hver deltager får tildelt et nummer i stedet for et navn, som vil blive registreret. Andre identificerende oplysninger, såsom barnets køn, alder og diagnose, vil også blive kodet med et tal.

Baseret på de forelagte oplysninger vil der blive udført en statistisk analyse af kovarianter, som sammenligner de målte NO-niveauer hos patienter med FASD med raske kontroller (med referenceområdet for normalen som offentliggjort i Mateo 2011 og Marthin 2011).

Ud over de nasale NO-målinger vil efterforskerne også udføre metabolomiske og proteomiske analyser for at måle niveauerne af nøglemetabolitter og proteiner i urinen hos patienter med FASD. Disse vil blive sammenlignet med de raske kontroller for yderligere at udforske denne hypotese om ciliær involvering. De metabolomiske analyser vil blive brugt til at måle nøglemetabolitter involveret i NO-vejen (arginin, citrullin, ornithin, asymmetrisk dimethylarginin) samt opløselige NO-biprodukter (nitrotyrosin, nitrotryptophan og 3-nitro-4-hydroxyphenyleddikesyre). Yderligere metabolomiske undersøgelser vil blive udført for at lede efter ændrede beta-oxidationsmarkører (acylcarnitiner), som kan påvirkes af ciliær dysfunktion, vitaminniveauer (f.eks. vitamin A og dets biprodukter) samt ændringer i katekolaminer (på grund af ændrede neuronale funktioner påvirket af cilia) i urin. De metabolomiske analyser vil blive udført ved hjælp af målrettede, MS-baserede metabolomiske metoder. Efterforskerne vil også udføre proteomisk analyse på urin hos FASD-patienter for at måle ændringer i centrale ciliære proteiner, nemlig polycystin-1 (PC-1)( PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocystin) samt acetyleret alfa-tubulin og sammenligne disse værdier for en gruppe raske børn. De proteomiske analyser vil bestå af en kombination af MS-baseret proteomik og immunoassays.

Data vil blive analyseret ved hjælp af PASW Statistics Version 19 (SPSS Inc., 2010). Alfa vil blive sat til 0,05 for alle analyser. Procentdelen af ​​børn, der scorer over og under alder og normbaserede afskæringsværdier på hver måling, vil blive beregnet.

For at afgøre, om de to grupper (FASD, sunde kontroller) adskiller sig i det målte niveau, vil en multivariat variansanalyse (MANOVA) blive udført på subskala-scoringer ved hjælp af gruppe som en mellem-emner-faktor.

Ved at bemærke, at stikprøvestørrelsen er lille, vil efterforskerne rapportere en effektstørrelse mellem grupperne for NO-niveauet og metabolomics-analysen samt et 95 % konfidensinterval for effektstørrelsen. Hypotesen er, at der er forskel på grupperne; i betragtning af at efterforskerne ikke kan bevise nulpunktet (dvs. mangel på et statistisk signifikant fund vil ikke bevise hypotesen), vil efterforskerne bruge denne effektstørrelse til i stedet at estimere effekten. Imidlertid antages det, at de nasale NO-niveauer og nøglemetabolitter i relation til NO hos børn med FASD vil blive reduceret i forhold til raske kontroller.

Efter afslutningen af ​​undersøgelsen vil de afidentificerede data blive opbevaret i en krypteret fil på den adgangskodebeskyttede computer i minimum fem år.