Transtorno do espectro alcoólico fetal - isso é uma ciliopatia?

Antecedentes: O termo "transtorno do espectro alcoólico fetal" (FASD) descreve um amplo espectro de apresentações do neurodesenvolvimento resultantes da exposição ao álcool no útero. A prevalência foi estimada em 1 em 100 pessoas e estimada em mais de 330.000 indivíduos afetados no Canadá. As Diretrizes de Diagnóstico Canadenses descrevem os efeitos físicos e neurodesenvolvimentais resultantes da exposição pré-natal ao álcool. Estes incluem características faciais distintas, microcefalia e déficits de desenvolvimento neurológico.

A toxicidade do etanol é pesquisada em associação com a concentração, duração e tempo de exposição ao etanol e os possíveis caminhos que levam à tradução fenotípica para a teratogênese. Estudos de FASD em modelos animais estão começando a implicar uma série de genes de suscetibilidade que estão envolvidos em várias vias moleculares nas interações gene-etanol. Alguns dos quais estão supostamente envolvidos na teratogênese do etanol como parte de seus papéis no controle de danos ao DNA, formação do eixo do Sistema Nervoso Central, sobrevivência celular, bem como proliferação e crescimento.

Uma mutação em um gene particular, neuronal óxido nítrico sintase (nNOS)) é conhecida por piorar a morte neuronal induzida pelo álcool tanto in vivo quanto in vitro, e a expressão do gene nNOS protege os neurônios contra a toxicidade do álcool O óxido nítrico (NO) é sintetizado pelo enzima óxido nítrico sintase (NOS até) L-arginina Existem três isoformas de NOS: NOS neuronal (nNOS, NOS-1), NOS induzível (iNOS, NOS-2) e NOS endotelial (eNOS, NOS-3). associado com a modulação da neurotransmissão e formação da memória juntamente com outras atividades vitais. Na presença de O2, formam-se radicais que podem levar à toxicidade. Eles podem interromper os processos de sinalização celular e resultar em condições patológicas.

Os dados sugerem que o etanol altera a expressão e a atividade da NOS no cérebro. Existem efeitos conhecidos do etanol na produção de NO, nas atividades da NOS e nas interações do NO com as enzimas do metabolismo do álcool.

A dose e a duração da exposição ao etanol são os principais fatores que determinam os efeitos do etanol na produção de NO, atividade de NOS ou expressão de NOS.

Anomalias cerebrais congênitas estruturais são descritas no contexto de FASD, incluindo microcefalia, anomalias de migração, defeitos do tubo neural, juntamente com anomalias cerebrais da linha média envolvendo o corpo caloso, anomalias cerebelares e hidrocefalia.

Os cílios são organelas semelhantes a antenas conservadas evolutivamente encontradas na superfície das células. Os cílios detectam diferentes estímulos extracelulares, como fluxo de fluidos, luz, cheiro e hormônios, por meio de receptores ciliares específicos, e desempenham papéis fundamentais na locomoção e divisão celular, movimento de fluidos, bem como no desenvolvimento embrionário de diferentes tecidos. No que diz respeito ao desenvolvimento neural, recentemente foi demonstrado que os fatores de crescimento ciliar desempenham um papel na migração e sinalização de células neuronais embrionárias, bem como na formação da linha média e lateralização do Sistema Nervoso Central (SNC). No organismo maduro, os cílios se estendem dos corpos basais das células ependimárias que revestem a superfície ventricular do cérebro, onde facilitam o fluxo do líquido cefalorraquidiano (LCR).

Os defeitos do sistema nervoso estão fortemente associados a várias ciliopatias, com achados comuns, incluindo defeitos da linha média, como hidrocefalia, defeitos do tubo neural e uma infinidade de anormalidades corticais e cerebelares.

O protótipo da doença ciliar humana foi a Discinesia Ciliar Primária (DCP). Na última década, um avanço significativo na compreensão da DCP levou a um melhor diagnóstico, principalmente pela constatação de que o óxido nítrico nasal (NO nasal) está bastante reduzido nesses pacientes. Sugere-se que o mecanismo dessa redução esteja relacionado à expressão reduzida de iNOs como parte da ciliopatia. A medição do NO nasal é um teste simples e não invasivo, facilmente realizado mesmo nos pacientes mais jovens.

Como a medição do NO é um teste simples e não invasivo com resultados imediatos, serve como um teste de triagem ideal para o diagnóstico sugestivo de várias ciliopatias, incluindo aquelas que envolvem malformações cerebrais.

Em trabalho recente, este grupo de pesquisa foi o primeiro a determinar uma conexão entre a disfunção ciliar medida pela concentração nasal de NO e anomalias isoladas do sistema nervoso central (SNC) da linha média. foi significativamente menor em comparação com o intervalo normal previamente estabelecido, com alguns estando dentro do intervalo de Discinesia Ciliar Primária (DCP). Trabalhos recentes mostram que a conectividade interneuronal, a morfogênese dos ventrículos cerebrais e a formação adequada do tubo neural dependem da função ciliar não interrompida.

Os cílios primários funcionam como resultado de proteínas de membrana, como policistina-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 e fibrocistina. A alfa tubulina acetilada é um marcador ciliar conhecido.

Alterações no PC-1 estão associadas a mutações tipo 1 da doença renal policística que foram associadas a defeitos de oxidação de ácidos graxos em testes metabolômicos e lipidômicos. A alfa tubulina acetilada é avaliada por análise proteinômica.

Hipótese: Dado o recente reconhecimento das interações entre NO com etanol e o importante papel dos cílios no desenvolvimento inicial do cérebro, os investigadores levantam a hipótese de que os cílios podem estar envolvidos em vias moleculares que levam a lesões cerebrais em crianças diagnosticadas com FASD. Tal mecanismo não foi previamente explorado.

Os investigadores levantam a hipótese de que os níveis de NO nasal, bem como os principais metabólitos em pacientes diagnosticados com FASD, serão reduzidos em comparação com controles saudáveis.

Objetivo: Este estudo terá como objetivo medir o NO nasal em um grupo selecionado de pacientes diagnosticados com Transtorno do Espectro Alcoólico Fetal, juntamente com análises metabolômicas e proteinômicas relacionadas aos principais metabólitos envolvidos na via do NO em amostras de urina, e compará-los com crianças saudáveis. Este estudo permitirá que os médicos empreguem potencialmente uma ferramenta de triagem não invasiva para pacientes pediátricos com suspeita de Transtorno do Espectro Alcoólico Fetal e considerem uma intervenção de desenvolvimento precoce.

Métodos: 10 crianças com idades entre 5 e 16 anos, diagnosticadas com FASD, serão recrutadas no ambulatório de FASD do Glenrose Rehabilitation Hospital. 10 crianças saudáveis ​​da mesma faixa etária serão recrutadas através do registro HICUPP para crianças saudáveis ​​(Pro00056156).

Os investigadores medirão os níveis de NO nasal inserindo uma linha de amostragem de NO inerte com uma oliva de espuma descartável (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) na narina da criança enquanto a narina contralateral é deixada aberta. O ar será então amostrado a uma taxa constante de 0,3 litros/min do nariz por um analisador quimioluminescente que fornece medição do nível nasal de NO em partes por bilhão (ppb). Todas as medidas de NO nasal serão realizadas com os sujeitos sentados.

As medições serão obtidas usando um analisador de NO (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Suíça). O analisador será calibrado de acordo com as especificações do fabricante. As medições serão feitas usando a técnica de fechamento do velum por meio da expiração de uma inspiração profunda por meio de um resistor fixo (cilindro de papelão descartável com abertura de 1 mm; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) por 20 a 40 segundos ou por meio de um brinquedo de festa. com uma resistência expiratória comparável. Ambos os tipos de resistor requerem um leve sopro das bochechas para desenvolver uma pressão na boca > 5 cm H2O, uma pressão suficiente para fechar o palato mole. As manobras serão realizadas de acordo com as diretrizes ATS/ERS. Em pacientes que não cooperam com a manobra acima, as medições serão feitas usando amostragem de respiração tidal.

O examinador inserirá o nível de NO medido diretamente em um arquivo de computador, que será salvo em um formato criptografado em um computador protegido por senha no Glenrose Rehabilitation Hospital. Informações de identificação, como nomes ou números de telefone dos participantes, não serão inseridas. Cada participante receberá um número em vez de um nome, que será registrado. Outras informações de identificação, como sexo, idade e diagnóstico da criança, também serão codificadas por meio de um número.

Com base nas informações fornecidas, será realizada uma análise estatística de covariantes, comparando os níveis medidos de NO de pacientes com FASD com controles saudáveis ​​(com o intervalo de referência do normal conforme publicado em Mateo 2011 e Marthin 2011).

Além das medições de NO nasal, os investigadores também conduzirão análises metabolômicas e proteômicas para medir os níveis de metabólitos e proteínas essenciais na urina de pacientes com FASD. Estes serão comparados aos controles saudáveis ​​para explorar ainda mais esta hipótese de envolvimento ciliar. As análises metabolômicas serão usadas para medir os principais metabólitos envolvidos na via do NO (arginina, citrulina, ornitina, dimetilarginina assimétrica), bem como subprodutos solúveis do NO (nitrotirosina, nitrotriptofano e ácido 3-nitro-4-hidroxifenilacético). Estudos metabolômicos adicionais serão realizados para procurar marcadores de beta-oxidação alterados (acilcarnitinas) que podem ser afetados por disfunção ciliar, níveis de vitaminas (esp. vitamina A e seus subprodutos), bem como alterações nas catecolaminas (devido a funções neuronais alteradas afetadas pelos cílios) na urina. As análises metabolômicas serão feitas usando métodos metabolômicos baseados em MS direcionados. Os investigadores também realizarão análises proteômicas na urina em pacientes com FASD para medir alterações nas principais proteínas ciliares, ou seja, policistina-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocistina), bem como alfa-tubulina acetilada e comparar esses valores a um grupo de crianças saudáveis. As análises proteômicas consistirão em uma combinação de proteômica baseada em MS e imunoensaios.

Os dados serão analisados ​​usando PASW Statistics Versão 19 (SPSS Inc., 2010). Alfa será definido em 0,05 para todas as análises. A porcentagem de crianças que pontuam acima e abaixo da idade e os valores de corte baseados na norma em cada medição serão computados.

Para determinar se os dois grupos (FASD, controles saudáveis) diferem no nível medido, uma Análise Multivariada de Variância (MANOVA) será conduzida em pontuações de subescala usando Grupo como um fator entre sujeitos.

Observando que o tamanho da amostra é pequeno, os investigadores irão relatar um tamanho de efeito entre os grupos para o nível de NO e a análise metabolômica, bem como um intervalo de confiança de 95% para o tamanho do efeito. A hipótese é que existe diferença entre os grupos; dado que os investigadores não podem provar o nulo (ou seja, a falta de um achado estatisticamente significativo não provará a hipótese), os investigadores usarão esse tamanho de efeito para estimar o efeito. No entanto, existe a hipótese de que os níveis nasais de NO e os principais metabólitos relacionados ao NO em crianças com FASD serão reduzidos em comparação com controles saudáveis.

Após a conclusão do estudo, os dados não identificados serão mantidos em um arquivo criptografado no computador protegido por senha por um período mínimo de cinco anos.