Фетальное расстройство алкогольного спектра – это цилиопатия?

Актуальность: Термин «расстройство фетального алкогольного спектра» (FASD) описывает широкий спектр нарушений развития нервной системы, возникающих в результате воздействия алкоголя в утробе матери. Распространенность оценивается в 1 случай на 100 человек, а в Канаде более 330 000 больных. Канадские диагностические рекомендации описывают последствия пренатального воздействия алкоголя на физическое и психическое развитие. К ним относятся отчетливые черты лица, микроцефалия и нарушения развития нервной системы.

Токсичность этанола исследуется в связи с концентрацией, продолжительностью и временем воздействия этанола, а также с возможными путями, ведущими к фенотипическому переводу в тератогенез. Исследования FASD на животных моделях начинают вовлекать ряд генов восприимчивости, которые участвуют в различных молекулярных путях во взаимодействиях ген-этанол. Некоторые из них, как сообщается, участвуют в тератогенезе этанола в рамках своей роли в контроле за повреждением ДНК, формировании оси центральной нервной системы, выживании клеток, а также в пролиферации и росте.

Известно, что мутация в одном конкретном гене, нейрональной синтазе оксида азота (nNOS), усугубляет вызываемую алкоголем гибель нейронов как in vivo, так и in vitro, а экспрессия гена nNOS защищает нейроны от отравления алкоголем. фермент синтазы оксида азота (NOS через) L-аргинин. Существует три изоформы NOS: нейрональная NOS (nNOS, NOS-1), индуцибельная NOS (iNOS, NOS-2) и эндотелиальная NOS (eNOS, NOS-3). связаны с модуляцией нейротрансмиссии и формированием памяти наряду с другими видами жизнедеятельности. В присутствии O2 образуются радикалы, которые могут привести к токсичности. Они могут нарушать процессы клеточной передачи сигналов и приводить к патологическим состояниям.

Данные свидетельствуют о том, что этанол изменяет экспрессию и активность NOS в головном мозге. Известно влияние этанола на выработку NO, активность NOS и взаимодействие NO с ферментами метаболизма алкоголя.

Доза и продолжительность воздействия этанола являются основными факторами, определяющими влияние этанола на продукцию NO, активность или экспрессию NOS.

Структурные врожденные аномалии головного мозга описаны в контексте ФАСН, включая микроцефалию, миграционные аномалии, дефекты нервной трубки, а также срединные аномалии головного мозга, включая мозолистое тело, аномалии мозжечка и гидроцефалию.

Реснички - это эволюционно законсервированные антенноподобные органеллы, обнаруженные на поверхности клеток. Реснички обнаруживают различные внеклеточные стимулы, такие как поток жидкости, свет, запах и гормоны, через специфические цилиарные рецепторы, и они играют ключевую роль в передвижении и делении клеток, движении жидкости, а также в эмбриональном развитии различных тканей. Что касается развития нервной системы, недавно было показано, что факторы роста ресничек играют роль в миграции и передаче сигналов эмбриональных нейрональных клеток, а также в формировании средней линии и латерализации центральной нервной системы (ЦНС). В зрелом организме реснички отходят от базальных тел эпендимальных клеток, выстилающих поверхность желудочков головного мозга, где они облегчают отток спинномозговой жидкости (ЦСЖ).

Дефекты нервной системы тесно связаны с рядом цилиопатий, с общими признаками, включая срединные дефекты, такие как гидроцефалия, дефекты нервной трубки и множество аномалий коры и мозжечка.

Прототипом цилиарной болезни человека была первичная цилиарная дискинезия (PCD). За последнее десятилетие значительный прогресс в понимании ПЦД привел к улучшению диагностики, в основном за счет того, что у этих пациентов значительно снижен назальный уровень оксида азота (назальный NO). Было высказано предположение, что механизм этого снижения связан со снижением экспрессии iNOs как части цилиопатии. Назальное измерение NO — это простой неинвазивный тест, который легко проводится даже у самых маленьких пациентов.

Поскольку измерение NO представляет собой простой неинвазивный тест с немедленными результатами, он служит идеальным скрининговым тестом для предполагаемой диагностики различных цилиопатий, в том числе связанных с пороками развития головного мозга.

В недавней работе эта исследовательская группа первой определила связь между цилиарной дисфункцией, измеряемой концентрацией NO в носу, и изолированными аномалиями центральной нервной системы (ЦНС) срединной линии. был значительно ниже по сравнению с ранее установленным нормальным диапазоном, причем некоторые из них находились в пределах диапазона первичной цилиарной дискинезии (ПЦД). Недавняя работа показывает, что межнейронная связность, морфогенез желудочков головного мозга и правильное формирование нервной трубки зависят от ненарушенной цилиарной функции.

Первичные реснички функционируют благодаря мембранным белкам, таким как polycystin-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 и фиброцистин. Ацетилированный альфа-тубулин является известным маркером ресничек.

Изменения в PC-1 связаны с мутациями поликистоза почек типа 1, которые, как было обнаружено, связаны с дефектами окисления жирных кислот в метаболомных и липидомных тестах. Ацетилированный альфа-тубулин оценивают с помощью протеиномного анализа.

Гипотеза: Учитывая недавнее признание взаимодействия между NO и этанолом и важную роль ресничек в раннем развитии мозга, исследователи предполагают, что реснички могут быть вовлечены в молекулярные пути, ведущие к повреждению головного мозга у детей с диагнозом ФАСН. Такой механизм ранее не изучался.

Исследователи предполагают, что уровни NO в носу, а также ключевые метаболиты у пациентов с диагнозом ФАСН будут снижены по сравнению со здоровыми людьми.

Цель: это исследование будет направлено на измерение назального NO у выбранной группы пациентов с диагнозом фетального расстройства алкогольного спектра, наряду с метаболомным и протеиномным анализом в отношении ключевых метаболитов, участвующих в пути NO в образцах мочи, и сравнение их со здоровыми детьми. Это исследование позволит клиницистам потенциально использовать неинвазивный инструмент скрининга для педиатрических пациентов с подозрением на алкогольное расстройство плода и рассмотреть возможность вмешательства на раннем этапе развития.

Методы: 10 детей в возрасте от 5 до 16 лет с диагнозом ФАСН будут набраны из амбулаторной клиники ФАСН в реабилитационной больнице Гленроуз. 10 здоровых детей того же возрастного диапазона будут отобраны через регистр здоровых детей HICUPP (Pro00056156).

Исследователи измерят уровень NO в носу, вставив трубку для отбора инертного NO с одноразовой поролоновой оливкой (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) в ноздрю ребенка, в то время как контралатеральная ноздря остается открытой. Затем воздух будет браться из носа с постоянной скоростью 0,3 л/мин с помощью хемилюминесцентного анализатора, который обеспечивает измерение уровня NO в носу в частях на миллиард (млрд). Все назальные измерения NO будут выполняться в сидячем положении.

Измерения будут получены с использованием анализатора NO (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Дюртен, Швейцария). Анализатор будет откалиброван в соответствии со спецификациями производителя. Измерения будут проводиться с использованием метода закрытия небной занавески на выдохе при глубоком вдохе через постоянный резистор (одноразовый картонный цилиндр с отверстием 1 мм; DirectMed Inc., Глен-Коув, Нью-Йорк) в течение 20–40 секунд или с помощью игрушки для вечеринок. с сопоставимым сопротивлением выдоху. Оба типа резисторов требуют легкого надувания щек, чтобы создать ротовое давление > 5 см H2O, давление, достаточное для закрытия мягкого неба. Маневры будут выполняться в соответствии с рекомендациями ATS/ERS. У пациентов, которые отказываются выполнять описанный выше маневр, измерения будут проводиться с использованием пробы дыхательного центра.

Исследователь вводит измеренный уровень NO непосредственно в компьютерный файл, который будет сохранен в зашифрованном формате на защищенном паролем компьютере в реабилитационной больнице Гленроуз. Идентифицирующая информация, такая как имена участников или номера телефонов, не будет введена. Каждому участнику вместо имени будет присвоен номер, который будет записан. Другая идентифицирующая информация, такая как пол ребенка, возраст и диагноз, также будет закодирована с помощью номера.

На основе предоставленной информации будет проведен статистический анализ сопутствующих вариантов, сравнивая измеренные уровни NO у пациентов с ФАСН с контрольной группой здоровых людей (с референтным диапазоном нормы, опубликованным в Mateo 2011 и Marthin 2011).

В дополнение к назальным измерениям NO исследователи также проведут метаболический и протеомный анализ для измерения уровней ключевых метаболитов и белков в моче пациентов с ФАСН. Их будут сравнивать со здоровыми и контрольными животными для дальнейшего изучения этой гипотезы вовлечения ресничек. Метаболический анализ будет использоваться для измерения ключевых метаболитов, участвующих в пути образования NO (аргинин, цитруллин, орнитин, асимметричный диметиларгинин), а также растворимых побочных продуктов NO (нитротирозин, нитротриптофан и 3-нитро-4-гидроксифенилуксусная кислота). Будут проведены дополнительные метаболомические исследования для поиска измененных маркеров бета-окисления (ацилкарнитинов), на которые может повлиять цилиарная дисфункция, уровни витаминов (особенно витамин А и его побочные продукты), а также изменения катехоламинов (из-за измененных функций нейронов, затронутых ресничками) в моче. Метаболический анализ будет проводиться с использованием целевых методов метаболомики на основе МС. Исследователи также проведут протеомный анализ мочи у пациентов с ФАСН, чтобы измерить изменения в ключевых цилиарных белках, а именно полицистине-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, фиброцистин), а также ацетилированном альфа-тубулине, и сравнить их. значения для группы здоровых детей. Протеомный анализ будет состоять из комбинации протеомики на основе МС и иммуноанализа.

Данные будут проанализированы с использованием PASW Statistics Version 19 (SPSS Inc., 2010). Альфа будет установлена ​​на 0,05 для всех анализов. Будет рассчитан процент детей, которые набрали больше и меньше баллов по возрасту, а также пороговые значения, основанные на норме, по каждому измерению.

Чтобы определить, различаются ли две группы (FASD, здоровые контроли) по измеренному уровню, будет проведен многомерный дисперсионный анализ (MANOVA) по подшкалам с использованием группы в качестве фактора между субъектами.

Отметив, что размер выборки невелик, исследователи сообщат о величине эффекта между группами для уровня NO и метаболомного анализа, а также о доверительном интервале 95% для величины эффекта. Гипотеза состоит в том, что между группами есть разница; учитывая, что исследователи не могут доказать нулевое значение (т. Е. Отсутствие статистически значимого результата не докажет гипотезу), исследователи будут использовать этот размер эффекта для оценки эффекта. Однако предполагается, что уровни NO в носу и ключевые метаболиты, относящиеся к NO, у детей с ФАСН будут снижены по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы.

После завершения исследования деидентифицированные данные будут храниться в зашифрованном файле на защищенном паролем компьютере не менее пяти лет.