Płodowe zaburzenia alkoholowe – czy to ciliopatia?

Wstęp: Termin „ze spektrum alkoholowych zaburzeń płodowych” (FASD) opisuje szerokie spektrum objawów neurorozwojowych wynikających z narażenia na alkohol in utero. Częstość występowania została oszacowana na 1 na 100 osób i szacuje się, że w Kanadzie dotyczy ponad 330 000 osób dotkniętych tą chorobą. Kanadyjskie wytyczne diagnostyczne opisują skutki fizyczne i neurorozwojowe wynikające z narażenia na alkohol w okresie prenatalnym. Należą do nich wyraźne rysy twarzy, małogłowie i deficyty neurorozwojowe.

Toksyczność etanolu jest badana w powiązaniu ze stężeniem, czasem trwania i czasem ekspozycji na etanol oraz możliwymi ścieżkami prowadzącymi do translacji fenotypowej do teratogenezy. Badania FASD na modelach zwierzęcych zaczynają implikować szereg genów podatności, które są zaangażowane w różne szlaki molekularne w interakcje gen-etanol. Niektóre z nich są podobno zaangażowane w teratogenezę etanolu jako część ich roli w kontroli uszkodzeń DNA, tworzeniu osi ośrodkowego układu nerwowego, przeżywalności komórek, a także proliferacji i wzroście.

Wiadomo, że mutacja w jednym konkretnym genie, neuronalnej syntazie tlenku azotu (nNOS) pogarsza śmierć neuronów wywołaną alkoholem zarówno in vivo, jak i in vitro, a ekspresja genu nNOS chroni neurony przed toksycznością alkoholu. Tlenek azotu (NO) jest syntetyzowany przez enzym syntaza tlenku azotu (NOS poprzez) L-arginina Istnieją trzy izoformy NOS: neuronalne NOS (nNOS, NOS-1), indukowalne NOS (iNOS, NOS-2) i śródbłonkowe NOS (eNOS, NOS-3). związane z modulacją neuroprzekaźnictwa i tworzeniem pamięci wraz z innymi czynnościami życiowymi. W obecności O2 tworzą się rodniki, które mogą prowadzić do toksyczności. Mogą zakłócać procesy sygnalizacji komórkowej i powodować stany patologiczne.

Dane sugerują, że etanol zmienia ekspresję i aktywność NOS w mózgu. Znany jest wpływ etanolu na wytwarzanie NO, aktywność NOS oraz interakcje NO z enzymami metabolizmu alkoholu.

Dawka i długość ekspozycji na etanol są głównymi czynnikami determinującymi wpływ etanolu na produkcję NO, aktywność NOS lub ekspresję NOS.

W kontekście FASD opisano strukturalne wady wrodzone mózgu, w tym małogłowie, anomalie migracyjne, wady cewy nerwowej wraz z anomaliami linii środkowej mózgu obejmującymi ciało modzelowate, anomalie móżdżku i wodogłowie.

Rzęski to zachowane ewolucyjnie organelle przypominające czułki, które znajdują się na powierzchni komórek. Rzęski wykrywają różne bodźce zewnątrzkomórkowe, takie jak przepływ płynu, światło, zapach i hormony poprzez określone receptory rzęskowe i odgrywają kluczową rolę w poruszaniu się i podziale komórek, ruchu płynów, a także w rozwoju embrionalnym różnych tkanek. Jeśli chodzi o rozwój neuronów, niedawno wykazano, że rzęskowe czynniki wzrostu odgrywają rolę w migracji i sygnalizacji embrionalnych komórek nerwowych, a także w tworzeniu linii środkowej i lateralizacji ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W dojrzałym organizmie rzęski rozciągają się od ciał podstawnych komórek wyściółki wyściełających komorową powierzchnię mózgu, gdzie ułatwiają przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).

Wady układu nerwowego są silnie związane z wieloma ciliopatiami, z częstymi objawami obejmującymi wady linii pośrodkowej, takie jak wodogłowie, wady cewy nerwowej oraz mnóstwo nieprawidłowości korowych i móżdżku.

Prototypem ludzkiej choroby rzęskowej była pierwotna dyskineza rzęsek (PCD). W ostatniej dekadzie znaczący postęp w zrozumieniu PCD doprowadził do poprawy diagnozy, głównie dzięki odkryciu, że nosowy tlenek azotu (NO) jest znacznie zmniejszony u tych pacjentów. Sugeruje się, że mechanizm tej redukcji jest związany ze zmniejszoną ekspresją iNO jako częścią ciliopatii. Nosowy pomiar NO jest prostym, nieinwazyjnym badaniem, które łatwo przeprowadzić nawet u najmłodszych pacjentów.

Ponieważ pomiar NO jest prostym, nieinwazyjnym testem dającym natychmiastowe wyniki, jest idealnym testem przesiewowym do sugestywnej diagnozy różnych ciliopatii, w tym wad rozwojowych mózgu.

W ostatnich pracach ta grupa badawcza jako pierwsza określiła związek między dysfunkcją rzęsek mierzoną stężeniem NO w nosie a izolowanymi anomaliami ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w linii środkowej. była znacznie niższa w porównaniu z wcześniej ustalonym zakresem normy, a niektóre mieściły się w zakresie pierwotnej dyskinezy rzęsek (PCD). Ostatnie prace pokazują, że łączność między neuronami, morfogeneza komór mózgowych i prawidłowe tworzenie cewy nerwowej zależą od niezakłóconej funkcji rzęsek.

Podstawowa funkcja rzęsek jest wynikiem białek błonowych, takich jak policystyna-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 i fibrocystyna. Acetylowana tubulina alfa jest znanym markerem rzęskowym.

Zmiany w PC-1 są związane z mutacjami policystycznych nerek typu 1, które okazały się być związane z defektami utleniania kwasów tłuszczowych w testach metabolomicznych i lipidomicznych. Acetylowana tubulina alfa jest oceniana za pomocą analizy proteinomicznej.

Hipoteza: Biorąc pod uwagę niedawne odkrycie interakcji między NO i etanolem oraz ważną rolę rzęsek we wczesnym rozwoju mózgu, badacze wysuwają hipotezę, że rzęski mogą być zaangażowane w szlaki molekularne prowadzące do uszkodzenia mózgu u dzieci, u których zdiagnozowano FASD. Taki mechanizm nie był wcześniej badany.

Badacze wysuwają hipotezę, że poziom NO w nosie, jak również kluczowych metabolitów u pacjentów z rozpoznaniem FASD będzie obniżony w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.

Cel: Celem pracy będzie pomiar nosowego NO w wybranej grupie pacjentek z rozpoznaniem Płodowych Zaburzeń Alkoholowych wraz z analizą metabolomiczną i proteinomiczną w odniesieniu do kluczowych metabolitów biorących udział w szlaku NO w próbkach moczu oraz porównanie ich ze zdrowymi dziećmi. Badanie to umożliwi klinicystom potencjalne zastosowanie nieinwazyjnego narzędzia przesiewowego dla pacjentów pediatrycznych z podejrzeniem Płodowych Zaburzeń Alkoholowych i rozważenie wczesnej interwencji rozwojowej.

Metody: 10 dzieci w wieku 5-16 lat, u których zdiagnozowano FASD, zostanie zrekrutowanych z poradni FASD w Szpitalu Rehabilitacyjnym Glenrose. 10 zdrowych dzieci w tym samym przedziale wiekowym zostanie zwerbowanych przez rejestr zdrowych dzieci HICUPP (Pro00056156).

Badacze zmierzą poziomy NO w nosie, wprowadzając obojętną linię do pobierania próbek NO z jednorazową piankową oliwką (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) do nozdrza dziecka, podczas gdy przeciwne nozdrze pozostaje otwarte. Powietrze będzie następnie pobierane ze stałą szybkością 0,3 litra/min z nosa przez analizator chemiluminescencyjny, który zapewnia pomiar poziomu NO w nosie w częściach na miliard (ppb). Wszystkie pomiary NOx w nosie będą wykonywane u osób siedzących.

Pomiary zostaną wykonane za pomocą analizatora NO (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Szwajcaria). Analizator zostanie skalibrowany zgodnie ze specyfikacjami producenta. Pomiary zostaną wykonane przy użyciu techniki zamykania podniebienia podniebiennego poprzez wydech z głębokiego wdechu przez stały opornik (jednorazowy, kartonowy cylinder z otworem 1 mm; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) przez 20-40 sekund lub przez dmuchaną zabawkę imprezową z porównywalnym oporem wydechowym. Oba typy rezystorów wymagają lekkiego nadymania policzków, aby wytworzyć w ustach ciśnienie > 5 cm H2O, ciśnienie wystarczające do zamknięcia podniebienia miękkiego. Manewry będą wykonywane zgodnie z wytycznymi ATS/ERS. U pacjentów, którzy nie chcą współpracować przy powyższym manewrze, pomiary zostaną wykonane przy użyciu próbkowania oddechu oddechowego.

Badający wprowadzi zmierzony poziom NO bezpośrednio do pliku komputerowego, który zostanie zapisany w zaszyfrowanym formacie na chronionym hasłem komputerze w Szpitalu Rehabilitacyjnym Glenrose. Informacje identyfikujące, takie jak nazwiska uczestników lub numery telefonów, nie zostaną wprowadzone. Każdemu uczestnikowi zostanie przydzielony numer zamiast imienia, które zostanie zapisane. Inne informacje identyfikujące, takie jak płeć dziecka, wiek i diagnoza, również zostaną zakodowane za pomocą numeru.

Na podstawie dostarczonych informacji zostanie przeprowadzona analiza statystyczna kowariantów, porównująca zmierzone poziomy NO u pacjentów z FASD z osobami zdrowymi (z zakresem referencyjnym normy opublikowanym w Mateo 2011 i Marthin 2011).

Oprócz pomiarów NO w nosie, badacze przeprowadzą również analizę metabolomiczną i proteomiczną, aby zmierzyć poziomy kluczowych metabolitów i białek w moczu pacjentów z FASD. Zostaną one porównane ze zdrowymi kontrolami w celu dalszego zbadania tej hipotezy zajęcia rzęsek. Analizy metabolomiczne posłużą do pomiaru kluczowych metabolitów biorących udział w szlaku NO (arginina, cytrulina, ornityna, asymetryczna dimetyloarginina) oraz rozpuszczalnych produktów ubocznych NO (nitrotyrozyna, nitrotryptofan i kwas 3-nitro-4-hydroksyfenylooctowy). Przeprowadzone zostaną dodatkowe badania metabolomiczne w celu znalezienia zmienionych markerów beta-oksydacji (acylokarnityny), na które może mieć wpływ dysfunkcja rzęsek, poziom witamin (zwł. witamina A i jej produkty uboczne), jak również zmiany katecholamin (spowodowane zmienionymi funkcjami neuronów, na które wpływają rzęski) w moczu. Analizy metabolomiczne zostaną przeprowadzone przy użyciu ukierunkowanych metod metabolomicznych opartych na MS. Badacze przeprowadzą również analizę proteomiczną moczu pacjentów z FASD w celu zmierzenia zmian w kluczowych białkach rzęskowych, a mianowicie policystyny-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocystyna), jak również acetylowanej alfa-tubuliny i porównają te wartości grupie zdrowych dzieci. Analizy proteomiczne będą składać się z połączenia proteomiki opartej na MS i testów immunologicznych.

Dane będą analizowane przy użyciu PASW Statistics Version 19 (SPSS Inc., 2010). Alfa zostanie ustawiona na 0,05 dla wszystkich analiz. Obliczony zostanie odsetek dzieci, które uzyskały wyniki powyżej i poniżej wieku oraz oparte na normach wartości odcięcia dla każdego pomiaru.

Aby określić, czy obie grupy (FASD, grupa kontrolna osób zdrowych) różnią się pod względem mierzonego poziomu, zostanie przeprowadzona wielowymiarowa analiza wariancji (MANOVA) na wynikach podskal z wykorzystaniem grupy jako czynnika międzyosobniczego.

Zauważając, że wielkość próby jest niewielka, badacze podają wielkość efektu między grupami dla poziomu NO i analizy metabolomicznej, a także 95% przedział ufności dla wielkości efektu. Hipoteza jest taka, że ​​istnieje różnica między grupami; biorąc pod uwagę, że badacze nie mogą udowodnić wartości zerowej (tj. brak statystycznie istotnego wyniku nie dowodzi hipotezy), badacze wykorzystają tę wielkość efektu, aby zamiast tego oszacować efekt. Przypuszcza się jednak, że poziomy NO w nosie i kluczowe metabolity związane z NO u dzieci z FASD będą obniżone w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.

Po zakończeniu badania dane pozbawione elementów umożliwiających identyfikację będą przechowywane w zaszyfrowanym pliku na komputerze chronionym hasłem przez co najmniej pięć lat.