Føtal alkoholspektrumforstyrrelse - er dette en ciliopati?

Bakgrunn: Begrepet "fetal alkoholspektrumforstyrrelse" (FASD) beskriver et bredt spekter av nevroutviklingspresentasjoner som er et resultat av alkoholeksponering in utero. Prevalensen er estimert til 1 av 100 personer, og anslått til å være mer enn 330 000 berørte individer i Canada. De kanadiske diagnostiske retningslinjene beskriver de fysiske og nevroutviklingseffektene som følge av prenatal alkoholeksponering. Disse inkluderer distinkte ansiktstrekk, mikrocefali og nevroutviklingsproblemer.

Etanoltoksisitet forskes på i forbindelse med konsentrasjonen, varigheten og tidspunktet for etanoleksponering og mulige veier som fører til fenotypisk oversettelse til teratogenese. Studier av FASD i dyremodeller begynner å implisere en rekke følsomhetsgener som er involvert i forskjellige molekylære veier på gen-etanol-interaksjoner. Noen av dem er angivelig involvert i etanolteratogenese som en del av deres roller i DNA-skadekontroll, dannelse av sentralnervesystemets akse, cellulær overlevelse samt spredning og vekst.

En mutasjon i ett bestemt gen, nevronal nitrogenoksidsyntase (nNOS)) er kjent for å forverre alkoholindusert nevronal død både in vivo og in vitro, og ekspresjon av nNOS-genet beskytter nevronene mot alkoholtoksisitet Nitrogenoksid (NO) syntetiseres av enzym nitrogenoksidsyntase (NOS gjennom) L-arginin Det er tre NOS-isoformer: neuronal NOS (nNOS, NOS-1), induserbar NOS (iNOS, NOS-2) og endotelial NOS (eNOS, NOS-3) .NO er assosiert med modulering av nevrotransmisjon og hukommelsesdannelse sammen med andre vitale aktiviteter. I nærvær av O2 dannes radikaler som kan føre til toksisitet. De kan være forstyrrende for cellesignaleringsprosesser og resultere i patologiske tilstander.

Data tyder på at etanol endrer NOS-uttrykk og aktivitet i hjernen. Det er kjente effekter av etanol på produksjon av NO, NOS-aktiviteter og interaksjoner av NO med alkoholmetabolismeenzymer.

Dose og lengde på etanoleksponering er hovedfaktorene som bestemmer etanoleffekter på NO-produksjon, NOS-aktivitet eller NOS-ekspresjon.

Strukturelle medfødte hjerneanomalier er beskrevet i sammenheng med FASD, inkludert mikrocefali, migrasjonsanomalier, nevrale rørdefekter sammen med hjerneanomalier i midtlinjen som involverer corpus callosum, cerebellare anomalier og hydrocephalus.

Cilia er evolusjonært konserverte antennelignende organeller som finnes på overflaten av celler. Cilia oppdager forskjellige ekstracellulære stimuli som væskestrøm, lys, lukt og hormoner gjennom spesifikke ciliære reseptorer, og de spiller nøkkelroller i cellebevegelse og deling, væskebevegelse, samt embryonal utvikling av forskjellige vev. Når det gjelder nevral utvikling, ble ciliære vekstfaktorer nylig vist å spille en rolle i embryonal nevronal cellemigrasjon og signalering, så vel som i dannelsen av sentralnervesystemet (CNS) midtlinje og lateralisering. I den modne organismen strekker flimmerhårene seg fra basallegemene til de ependymale cellene som langs den ventrikulære overflaten av hjernen, hvor de letter strømmen av Cerebro Spinal Fluid (CSF).

Nervesystemdefekter er sterkt assosiert med en rekke ciliopatier, med vanlige funn inkludert midtlinjedefekter som hydrocephalus, nevrale rørdefekter og en mengde kortikale og cerebellare abnormiteter.

Prototypen av menneskelig ciliær sykdom har vært primær ciliær dyskinesi (PCD). I løpet av det siste tiåret har betydelige fremskritt i forståelsen av PCD ført til forbedret diagnose, hovedsakelig ved funnet at nasal nitrogenoksid (nasal NO) er sterkt redusert hos disse pasientene. Mekanismen for denne reduksjonen har blitt foreslått å være relatert til redusert iNOs uttrykk som en del av ciliopatien. Nasal NO-måling er en enkel ikke-invasiv test som enkelt kan utføres selv hos de yngste pasientene.

Siden NO-måling er en enkel ikke-invasiv test med umiddelbare resultater, fungerer den som en ideell screeningtest for suggestiv diagnose av ulike ciliopatier, inkludert de som involverer hjernemisdannelser.

I nyere arbeid var denne forskergruppen den første til å fastslå en sammenheng mellom ciliær dysfunksjon målt ved nasal NO-konsentrasjon og isolerte midtlinjeavvik fra sentralnervesystemet (CNS) Det generelle gjennomsnittlige NO-nivået i nesen hos barn med isolerte midtlinje-CNS-anomalier i studien, var betydelig lavere sammenlignet med det tidligere etablerte normalområdet, med noen innenfor området for primær ciliær dyskinesi (PCD). Nyere arbeid viser at inter nevronal tilkobling, hjerneventriklenes morfogenese og riktig dannelse av nevralrøret er avhengig av ikke-avbrutt ciliær funksjon.

De primære flimmerhårene fungerer som et resultat av membranproteiner som polycystin-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 og fibrocystin. Acetylert alfa-tubulin er en kjent ciliær markør.

Endringer i PC-1 er assosiert med polycystisk nyresykdom type 1 mutasjoner som ble funnet å være assosiert med fettsyreoksidasjonsdefekter i metabolomiske og lipidomiske tester. Acetylert alfa-tubulin vurderes gjennom proteinomisk analyse.

Hypotese: Gitt den nylige erkjennelsen av interaksjonene mellom NO med etanol og den viktige rollen til cilia i tidlig hjerneutvikling, antar etterforskerne at cilia kan være involvert i molekylære veier som fører til hjerneskade hos barn som er diagnostisert med FASD. En slik mekanisme har ikke blitt utforsket tidligere.

Etterforskerne antar at nasale NO-nivåer så vel som de viktigste metabolittene hos pasienter diagnostisert med FASD vil bli redusert sammenlignet med friske kontroller.

Mål: Denne studien vil ta sikte på å måle nasal NO i en utvalgt gruppe pasienter diagnostisert med føtal alkoholspektrumforstyrrelse, sammen med metabolomikk og proteinomisk analyse relatert til nøkkelmetabolitter involvert i NO-vei i urinprøver, og sammenligne dem med friske barn. Denne studien vil gjøre det mulig for klinikere å potensielt bruke et ikke-invasivt screeningverktøy for pediatriske pasienter med mistanke om føtal alkoholspektrumforstyrrelse og vurdere en tidlig utviklingsintervensjon.

Metoder: 10 barn i alderen 5-16 år, som er diagnostisert med FASD, vil bli rekruttert fra FASD poliklinikk ved Glenrose Rehabilitation Hospital. 10 friske barn i samme aldersgruppe vil bli rekruttert gjennom HICUPP-registeret for friske barn (Pro00056156).

Etterforskerne vil måle NO-nivåer i nesen ved å sette inn en inert NO-prøveslange med en engangsskumoliven (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) inn i barnets nesebor mens det kontralaterale neseboret er åpent. Luft vil deretter prøves med en konstant hastighet på 0,3 liter/min fra nesen av en kjemiluminescensanalysator som gir måling av det nasale NO-nivået i deler per milliard (ppb). Alle nese NO-målinger vil bli utført med forsøkspersonene sittende.

Målinger vil bli oppnådd ved bruk av en NO-analysator (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Sveits). Analysatoren vil bli kalibrert i henhold til produsentens spesifikasjoner. Målinger vil bli foretatt ved bruk av velum-lukkingsteknikk via utånding fra dyp inspirasjon gjennom en fast motstand (engangs, pappsylinder med 1 mm åpning; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) i 20-40 sekunder eller via en festlig utblåsningsleke. med en sammenlignbar ekspirasjonsmotstand. Begge motstandstyper krever lett pust i kinnene for å utvikle et munntrykk > 5 cm H2O, et trykk som er tilstrekkelig til å lukke den myke ganen. Manøvrene vil bli utført i henhold til ATS/ERS retningslinjer. Hos pasienter som ikke samarbeider med ovennevnte manøver vil målingene gjøres ved hjelp av tidevannspusteprøver.

Undersøkeren vil legge inn det målte NO-nivået direkte i en datafil, som lagres i et kryptert format på en passordbeskyttet datamaskin ved Glenrose Rehabilitation Hospital. Identifikasjonsopplysninger som deltakeres navn eller telefonnumre vil ikke bli oppgitt. Hver deltaker vil bli tildelt et nummer i stedet for et navn, som registreres. Annen identifiserende informasjon, som barnets kjønn, alder og diagnose, vil også bli kodet med et tall.

Basert på gitt informasjon, vil det bli utført en statistisk analyse av kovarianter, som sammenligner de målte NO-nivåene til pasienter med FASD med friske kontroller (med referanseområdet til normalen som publisert i Mateo 2011 og Marthin 2011).

I tillegg til de nasale NO-målingene, vil etterforskerne også utføre metabolomiske og proteomiske analyser for å måle nivåene av nøkkelmetabolitter og proteiner i urin hos pasienter med FASD. Disse vil bli sammenlignet med de friske kontrollene for å utforske denne hypotesen om ciliær involvering ytterligere. De metabolomiske analysene vil bli brukt til å måle nøkkelmetabolitter involvert i NO-veien (arginin, citrullin, ornitin, asymmetrisk dimetylarginin) samt løselige NO-biprodukter (nitrotyrosin, nitrotryptofan og 3-nitro-4-hydroksyfenyleddiksyre). Ytterligere metabolomiske studier vil bli utført for å se etter endrede beta-oksidasjonsmarkører (acylkarnitiner) som kan påvirkes av ciliær dysfunksjon, vitaminnivåer (f.eks. vitamin A og dets biprodukter) samt endringer i katekolaminer (på grunn av endrede nevronale funksjoner påvirket av flimmerhår) i urin. De metabolomiske analysene vil bli gjort ved hjelp av målrettede, MS-baserte metabolomiske metoder. Etterforskerne vil også utføre proteomisk analyse på urin hos FASD-pasienter for å måle endringer i sentrale ciliære proteiner, nemlig polycystin-1 (PC-1)( PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocystin) samt acetylert alfa-tubulin og sammenligne disse verdier for en gruppe friske barn. De proteomiske analysene vil bestå av en kombinasjon av MS-basert proteomikk og immunoassays.

Data vil bli analysert ved hjelp av PASW Statistics Version 19 (SPSS Inc., 2010). Alfa vil bli satt til 0,05 for alle analyser. Prosentandelen av barn som skårer over og under alder og normbaserte grenseverdier på hver måling vil bli beregnet.

For å avgjøre om de to gruppene (FASD, sunne kontroller) er forskjellige i det målte nivået, vil en multivariat variansanalyse (MANOVA) bli utført på subskala-skårer ved å bruke Gruppe som en mellom-emne-faktor.

Ved å merke seg at prøvestørrelsen er liten, vil etterforskerne rapportere en effektstørrelse mellom gruppene for NO-nivået og metabolomikkanalysen, samt et 95 % konfidensintervall for effektstørrelsen. Hypotesen er at det er forskjell mellom gruppene; gitt at etterforskerne ikke kan bevise null (dvs. mangel på statistisk signifikant funn vil ikke bevise hypotesen), vil etterforskerne bruke denne effektstørrelsen til i stedet å estimere effekten. Imidlertid er det antatt at de nasale NO-nivåene og nøkkelmetabolitter relatert til NO hos barn med FASD vil bli redusert sammenlignet med friske kontroller.

Etter fullføring av studien vil de avidentifiserte dataene oppbevares i en kryptert fil på den passordbeskyttede datamaskinen i minimum fem år.