Intraoperační molekulární diagnostika sentinelové lymfatické uzliny u pacientek s rakovinou prsu

Pacienti:

Do studie bylo zařazeno více než 1000 po sobě jdoucích pacientek s rakovinou prsu, u kterých byla provedena biopsie sentinelové lymfatické uzliny (SLNB). Studie byla schválena etickou komisí každého centra a každý pacient poskytl informovaný souhlas. Pacienti, kteří podstoupili předchozí ipsilaterální axilární operaci, byli z této studie vyloučeni.

Metoda odběru vzorků:

Sentinelová lymfatická uzlina (SLN) byla po SLNB odtučněna. V případě, že uzel vážil méně než 100 mg, byla uzel hodnocena histologicky až pooperačně. Pokud uzel vážil více než 100 mg, byl uzel rozřezán na stejné bloky podle délky krátké osy: Pokud byla délka menší než 4 mm, uzel byl rozřezán na dva bloky podél dlouhé osy (a, b). Intraoperačně byly bloky a a b testovány TIC a blok a byl připraven pro OSNA. Pooperačně byl blok b hodnocen histologicky. Pokud byla délka větší než 4 mm, byl uzel rozřezán na čtyři bloky (a, b, c, d). Intraoperačně byly všechny bloky (a, b, c, d) testovány TIC a bloky a a c byly připraveny pro OSNA. Pooperačně byly bloky b a d podrobeny histologii. ALND byla provedena pouze v případě, že výsledky TIC byly pozitivní.

Test OSNA:

Všichni operátoři testu absolvovali před studií třídenní školicí kurz. OSNA test byl proveden podle pokynů výrobce. Ke konstrukci standardní křivky na přístroji Sysmex RD-100i byly použity tři různé kalibrátory s definovanými koncentracemi kopií CK-19 mRNA. Poté byly tkáně uzlin homogenizovány ve 4 ml homogenizačního pufru Sysmex LYNORHAG. Poté byl homogenát krátce odstředěn a přímo použit jako templát pro RT-LAMP. Amplifikace CK-19 mRNA byla automaticky provedena v přístroji SysmexTM RD-100i s reagenční sadou Sysmex LYNOAMP připravenou k použití, která se skládá ze směsi primer-nukleotid, enzymů a kalibrátorů mRNA CK-19 a také pozitivní a negativní kontroly . Všechny výsledky byly prezentovány na přístroji RD-100i v kvalitativních kategoriích [++, +, -] a dále specifikovány počtem kopií CK-19 mRNA/μl: ~250 kopií [-], 250~5000 kopií [+], a 5000~ [++]. Výsledek [+] byl srovnatelný s přítomností mikrometastázy a [++] s makrometastázou.

Histologické hodnocení:

Všechny bloky uzlin použité pro histologické hodnocení byly fixovány v 10% pufrovaném formalínu a zalité v parafínu. Z každého bloku byla odebrána čtyři sklíčka o tloušťce 4 ~ 6 μm vzdálená od sebe 200 μm. Metastázy větší než 0,2 mm byly v této studii považovány za pozitivní. Metastázy byly klasifikovány podle 7. kritéria American Joint Cancer Committee. Makrometastázy (≥2 mm) a mikrometastázy (0,2~2 mm, pT1mic) byly považovány za pozitivní uzliny. Izolované nádorové buňky [≤0,2 mm, ITC, pT0(i+)] byly považovány za negativní uzliny. Všechny preparáty byly přezkoumány starším patologem z jiného centra. Když došlo k neshodě, byl navštíven třetí starší patolog, aby stanovil konečnou diagnózu. Všichni patologové byli zaslepeni výsledky OSNA.

Statistické metody:

Primárním cílem byla přesnost, senzitivita a specificita stanovení OSNA. Pro srovnání četnosti mezi skupinami byl proveden McNemarův test.