Intraoperative molekulare Diagnose von Sentinel-Lymphknoten bei Brustkrebspatientinnen

Patienten:

Mehr als 1000 konsekutive Brustkrebspatientinnen, bei denen eine Sentinel-Lymphknotenbiopsie (SLNB) vorgesehen war, wurden in die Studie aufgenommen. Die Studie wurde von der Ethikkommission jedes Zentrums genehmigt und jeder Patient gab eine Einverständniserklärung nach Aufklärung ab. Die Patienten, die sich zuvor einer ipsilateralen Achseloperation unterzogen hatten, wurden von dieser Studie ausgeschlossen.

Probenahmeverfahren:

Sentinel Lymph Node (SLN) wurde nach SLNB entfettet. Wenn der Knoten weniger als 100 mg wog, wurde der Knoten nur postoperativ histologisch beurteilt. Wenn der Knoten mehr als 100 mg wog, wurde der Knoten entsprechend der Länge der kurzen Achse in gleiche Blöcke geschnitten: Wenn die Länge weniger als 4 mm betrug, wurde der Knoten entlang der langen Achse (a, b) in zwei Blöcke geschnitten. Intraoperativ wurden Block a und b per TIC getestet und Block a für OSNA präpariert. Postoperativ wurde der Block b histologisch beurteilt. Wenn die Länge mehr als 4 mm betrug, wurde der Knoten in vier Blöcke geschnitten (a, b, c, d). Intraoperativ wurden alle Blöcke (a, b, c, d) mit TIC getestet und die Blöcke a und c für die OSNA präpariert. Postoperativ wurden die Blöcke b und d einer Histologie unterzogen. ALND wurde nur durchgeführt, wenn die TIC-Ergebnisse positiv waren.

OSNA-Assay:

Alle Assay-Operatoren nahmen vor der Studie an einem dreitägigen Schulungskurs teil. Der OSNA-Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Drei verschiedene Kalibratoren mit definierten CK-19-mRNA-Kopienkonzentrationen wurden verwendet, um eine Standardkurve auf dem Sysmex RD-100i-Instrument zu erstellen. Dann wurden Knotengewebe in 4 ml Homogenisierungspuffer Sysmex LYNORHAG homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat kurz zentrifugiert und direkt als Template für RT-LAMP verwendet. Die Amplifikation von CK-19-mRNA wurde automatisch im SysmexTM RD-100i-Instrument mit einem gebrauchsfertigen Reagenzien-Sysmex LYNOAMP-Kit durchgeführt, das aus einem Primer-Nukleotid-Mix, Enzymen und CK-19-mRNA-Kalibratoren sowie Positiv- und Negativkontrollen besteht . Alle Ergebnisse wurden auf dem RD-100i-Instrument in qualitativen Kategorien [++, +, -] präsentiert und weiter spezifiziert durch CK-19-mRNA-Kopienzahl/μl: ~250 Kopien [-], 250~5000 Kopien [+], und 5000~ [++]. Das Ergebnis [+] war vergleichbar mit dem Vorliegen einer Mikrometastase und [++] mit einer Makrometastase.

Histologische Auswertung:

Alle für die histologische Bewertung verwendeten Knotenblöcke wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Aus jedem Block wurden vier 4~6 μm dicke Objektträger im Abstand von 200 μm entnommen. Metastasen größer als 0,2 mm wurden in dieser Studie als positiv gewertet. Metastasen wurden gemäß dem 7. Kriterium des American Joint Cancer Committee klassifiziert. Makrometastasen (≥2 mm) und Mikrometastasen (0,2~2 mm, pT1mic) wurden als knotenpositiv angesehen. Isolierte Tumorzellen [≤0,2 mm, ITCs, pT0(i+)] wurden als nodal-negativ betrachtet. Alle Objektträger wurden von einem leitenden Pathologen eines anderen Zentrums überprüft. Bei Meinungsverschiedenheiten wurde ein dritter leitender Pathologe hinzugezogen, um die endgültige Diagnose zu stellen. Alle Pathologen waren gegenüber den OSNA-Ergebnissen blind.

Statistische Methoden:

Das primäre Ziel war die Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität des OSNA-Assays. Der McNemar-Test wurde durchgeführt, um die Rate zwischen den Gruppen zu vergleichen.