Diagnosi molecolare intraoperatoria del linfonodo sentinella in pazienti con carcinoma mammario

Pazienti:

Sono state arruolate nello studio più di 1000 pazienti con carcinoma mammario consecutive in attesa di biopsia del linfonodo sentinella (SLNB). Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ogni centro e ogni paziente ha fornito il proprio consenso informato. I pazienti sottoposti a precedente intervento chirurgico ascellare ipsilaterale sono stati esclusi da questo studio.

Metodo di campionamento:

Il linfonodo sentinella (SLN) è stato sgrassato dopo SLNB. Se il nodo pesava meno di 100 mg, il nodo è stato valutato solo dall'istologia postoperatoria. Se il nodo pesava più di 100 mg, il nodo veniva tagliato in blocchi uguali in base alla lunghezza dell'asse corto: se la lunghezza era inferiore a 4 mm, il nodo veniva tagliato in due blocchi lungo l'asse lungo (a, b). Intraoperatoriamente, i blocchi aeb sono stati testati mediante TIC e il blocco a è stato preparato per OSNA. Dopo l'intervento, il blocco b è stato valutato dall'istologia. Se la lunghezza era superiore a 4 mm, il nodo veniva suddiviso in quattro blocchi (a, b, c, d). Intraoperatoriamente, tutti i blocchi (a, b, c, d) sono stati testati mediante TIC e il blocco a e c sono stati preparati per OSNA. Dopo l'intervento, i blocchi b e d sono stati sottoposti ad esame istologico. L'ALND è stato eseguito solo se i risultati del TIC erano positivi.

Saggio OSNA:

Tutti gli operatori del test hanno frequentato un corso di formazione di tre giorni prima dello studio. Il dosaggio OSNA è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore. Per costruire una curva standard sullo strumento Sysmex RD-100i sono stati utilizzati tre diversi calibratori con concentrazioni definite di copie dell'mRNA di CK-19. Quindi, i tessuti dei nodi sono stati omogeneizzati in 4 ml di tampone omogeneizzante Sysmex LYNORHAG. Successivamente, l'omogenato è stato brevemente centrifugato e utilizzato direttamente come modello per RT-LAMP. L'amplificazione dell'mRNA di CK-19 è stata eseguita automaticamente nello strumento SysmexTM RD-100i con un kit di reagenti Sysmex LYNOAMP pronto all'uso che consiste in una miscela di primer-nucleotide, enzimi e calibratori di mRNA di CK-19 nonché controlli positivi e negativi . Tutti i risultati sono stati presentati sullo strumento RD-100i in categorie qualitative [++, +, -] e ulteriormente specificati dal numero di copie dell'mRNA di CK-19/μl: ~250 copie [-], 250~5000 copie [+], e 5000~ [++]. Il risultato [+] è stato paragonabile alla presenza di una micrometastasi, e [++] a una macrometastasi.

Valutazione istologica:

Tutti i blocchi di nodi utilizzati per la valutazione istologica sono stati fissati in formalina tamponata al 10% e inclusi in paraffina. Da ciascun blocco sono stati prelevati quattro vetrini spessi 4 ~ 6 μm distanti 200 μm. Le metastasi superiori a 0,2 mm sono state considerate positive in questo studio. Le metastasi sono state classificate secondo il 7° criterio dell'American Joint Cancer Committee. Le macro-metastasi (≥2 mm) e le micro-metastasi (0,2~2 mm, pT1mic) sono state considerate linfonodi positivi. Le cellule tumorali isolate [≤0,2 mm, ITC, pT0(i+)] sono state considerate linfonodi negativi. Tutti i vetrini sono stati esaminati da un patologo senior di un altro centro. Quando c'era un disaccordo, un terzo patologo senior veniva assistito per fare la diagnosi finale. Tutti i patologi erano all'oscuro dei risultati dell'OSNA.

Metodi statistici:

L'obiettivo primario era l'accuratezza, la sensibilità e la specificità del dosaggio OSNA. Il test di McNemar è stato eseguito per confrontare il tasso tra i gruppi.