Diagnóstico Molecular Intraoperatório de Linfonodo Sentinela em Pacientes com Câncer de Mama

Pacientes:

Mais de 1.000 pacientes consecutivos com câncer de mama agendados para biópsia de linfonodo sentinela (SLNB) foram incluídos no estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética de cada centro e cada paciente forneceu consentimento informado. As pacientes que haviam sido submetidas a cirurgia axilar ipsilateral prévia foram excluídas deste estudo.

Método de amostragem:

Linfonodo Sentinela (SLN) foi desengordurado após SLNB. Se o nódulo pesasse menos de 100mg, o nódulo só foi avaliado por histologia no pós-operatório. Se o nódulo pesasse mais de 100 mg, o nó era cortado em blocos iguais de acordo com o comprimento do eixo curto: Se o comprimento fosse menor que 4 mm, o nó era cortado em dois blocos ao longo do eixo longo (a, b). No intraoperatório, os blocos aeb foram testados por TIC, e o bloco a foi preparado para OSNA. No pós-operatório, o bloco b foi avaliado pela histologia. Se o comprimento fosse superior a 4 mm, o nó era cortado em quatro blocos (a, b, c, d). No intraoperatório, todos os blocos (a, b, c, d) foram testados por TIC, e os blocos aec foram preparados para OSNA. No pós-operatório, os blocos b e d foram submetidos à histologia. A ALND só foi realizada se os resultados do TIC fossem positivos.

Ensaio OSNA:

Todos os operadores de ensaio participaram de um curso de treinamento de três dias antes do estudo. O ensaio OSNA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Três calibradores diferentes com concentrações definidas de cópias de mRNA de CK-19 foram usados ​​para construir uma curva padrão no instrumento Sysmex RD-100i. Em seguida, os tecidos dos nódulos foram homogeneizados em 4 ml de tampão de homogeneização Sysmex LYNORHAG. Em seguida, o homogeneizado foi brevemente centrifugado e usado diretamente como molde para o RT-LAMP. A amplificação do mRNA CK-19 foi realizada automaticamente no instrumento SysmexTM RD-100i com um kit Sysmex LYNOAMP de reagente pronto para uso, que consiste em uma mistura de primer-nucleotídeo, enzimas e calibradores de mRNA CK-19, bem como controles positivos e negativos . Todos os resultados foram apresentados no instrumento RD-100i em categorias qualitativas [++, +, -] e posteriormente especificados pelo número de cópias de mRNA CK-19/μl: ~250 cópias [-], 250~5000 cópias [+], e 5000~ [++]. O resultado [+] foi comparável à presença de uma micrometástase e [++] a uma macrometástase.

Avaliação histológica:

Todos os blocos de nodos usados ​​para avaliação histológica foram fixados em formalina tamponada a 10% e embebidos em parafina. Quatro lâminas de 4 ~ 6μm de espessura com 200μm de distância foram retiradas de cada bloco. Metástases maiores que 0,2mm foram consideradas positivas neste estudo. As metástases foram classificadas de acordo com o 7º critério do American Joint Cancer Committee. Macrometástases (≥2mm) e micrometástases (0,2~2mm, pT1mic) foram consideradas linfonodos positivos. Células tumorais isoladas [≤0,2mm, ITCs, pT0(i+)] foram consideradas linfonodos negativos. Todas as lâminas foram revisadas por um patologista sênior de outro centro. Quando houve discordância, um terceiro patologista sênior foi atendido para fazer o diagnóstico final. Todos os patologistas desconheciam os resultados da OSNA.

Métodos estatísticos:

O objetivo principal era a precisão, sensibilidade e especificidade do ensaio OSNA. O teste de McNemar foi realizado para comparar a taxa entre os grupos.