Role protizánětlivých cytokinů a biomarkerů antimikrobiálního peptidu LL-37 v léčbě onemocnění parodontu.

Role protizánětlivých cytokinů a biomarkerů antimikrobiálního peptidu LL-37 v léčbě onemocnění parodontu.

1. Úvod

   Parodontální onemocnění je infekční proces, který spočívá v destrukci podpůrných anatomických struktur zubu v důsledku zánětlivé reakce na periopatogenní aktivitu subgingiválního bakteriálního plaku, která vede k vrozené, zánětlivé a adaptivní imunitní reakci.

   Klinická manifestace onemocnění závisí na faktorech hostitele a prostředí a také na konkrétním mikrobiologickém agens. Vzájemný vztah mezi bakteriemi a imunitními obrannými mechanismy hostitele tvoří základ imunopatologických mechanismů, které vedou k onemocnění. Ve zdravých podmínkách existuje rovnováha mezi aktivitou parodontální mikrobioty a imunitní reakcí hostitele.

   Ve vrozeném obranném systému ústní dutiny je zapojeno několik antimikrobiálních peptidů, jedním z nich je lidský katelicidin LL-37.

   Aktivita antimikrobiálních peptidů jako je LL-37 v gingiválním sulku je považována za jeden z největších obranných mechanismů parodontu. Gingivální epitel tvoří nejen fyzickou bariéru, která zabraňuje bakteriální invazi. Neutrofily migrují do junkčního epitelu a vytvářejí bariéru mezi bakteriálním plakem a podložním epitelem. Produkují také antimikrobiální peptidy, jeden z nich 18 kDa (hCAP18). Jakmile jsou neutrofily aktivovány v reakci na bakteriální agresi, uvolní se LL-37 s podobnou aktivitou jako širokospektré antibiotikum.

   Úplná absence tohoto peptidu (LL-37) je spojována s agresivní parodontitidou, zejména u pacientů s nedostatkem neutrofilů, jako jsou pacienti trpící Morfan Kosmannovým syndromem.

   Povaha tohoto výzkumu si klade za cíl objasnit roli LL-37 při onemocnění parodontu porovnáním použití neinvazivní techniky, jako jsou vzorky štěrbinové tekutiny u pacientů trpících onemocněním parodontu, před a po absolvování základní periodontální léčby (kořenové škálování a hoblování). Kromě výše uvedeného budou také hodnoceny pro a protizánětlivé cytokiny (zejména IL-6, IL-4, IL-10) před a po periodontální léčbě. Získané vzorky budou analyzovány imunohystochemickou analýzou (ELISA). Kvantifikace LL-37 před a po periodontální léčbě spojená s pozorovanými klinickými nálezy může sloužit jako diagnostický biomarker imunopatologické odpovědi vlastní periodontálnímu onemocnění.

2. Odůvodnění výzkumné otázky. Aktuální stav

   V posledních letech bylo vynaloženo velké úsilí vědecké komunity, aby se pokusila porozumět komplexním imunopatologickým procesům souvisejícím s onemocněním parodontu a vztahu mezi aktivitou parodontální mikrobioty a obrannými mechanismy hostitele.

   Relevantnost tohoto výzkumu může posloužit k podrobnějšímu pochopení úlohy antimikrobiálního peptidu LL-37 u onemocnění parodontu nejen díky jejich baktericidnímu účinku, ale také v modulaci imunologické odpovědi hostitele a jeho aktivity před a po léčbě parodontu. . Nedostatek studií na toto téma odráží potřebu dalšího výzkumu na toto téma.

   Závěry tohoto výzkumu mohou tvořit základ nového terapeutického přístupu založeného na použití LL-37, který pomáhá modulovat imunologickou odpověď hostitele v kombinaci s konvenční parodontální léčbou. To může být zvláště důležité u pacientů náchylných k rozvoji periodontálních nebo periimplantátových onemocnění nebo ve zvláštních případech, které jsou odolné vůči konvenčním alternativám léčby.

3. Shrnutí zamýšleného výzkumu

Hlavním cílem studie je prozkoumat roli LL-37 v imunopatologické odpovědi parodontu. Následným cílem je prozkoumat možnost použití tohoto mikrobiálního peptidu jako diagnostického, prognostického i terapeutického činidla při léčbě onemocnění parodontu.

Výzkumná hypotéza: Existují významné kvantitativní rozdíly v hladinách LL-37 před a po parodontologickém ošetření, s významným snížením LL-37 při přehodnocení (4-6 týdnů po kúře základního parodontálního ošetření – odlupování a hoblování kořenů ).

Nulová hypotéza: Neexistují žádné významné kvantitativní rozdíly v hladinách LL-37 před a po parodontologickém ošetření

Cíle této studie jsou:

1. Zjistěte, zda zdraví pacienti a pacienti s periodontálním onemocněním mají různé hladiny LL-37, IL-6, IL-4 a IL-10 v crevikulární tekutině na začátku a přiřaďte je ke stádiu/závažnosti periodontálního onemocnění.
2. Vyhodnoťte, zda po základní periodontální léčbě jsou tyto hladiny LL-37, IL-6, IL-4 a IL-10 na začátku podobné kvantifikovaným hladinám u zdravých pacientů na začátku.
3. Pokud jde o vzorky štěrbinové tekutiny, vyhodnoťte, zda se hladiny LL-37, IL-6, IL-4 a IL-10 v zubech postižených periodontálním onemocněním liší od zdravých míst u stejného jedince nebo zda neexistují žádné významné rozdíly ve výše uvedeném před a po parodontologickém ošetření.
4. Stanovte neinvazivní protokol pro hodnocení imunologického stavu pacienta před a po parodontologické léčbě jako prognostického faktoru.

4. Materiál a metody

Bylo uděleno etické schválení od Etického výboru univerzity Rey Juan Carlos z Madridu (URJC). Bude proveden výběr pacientů z "Master in Advanced Implantology, Tissue Regeneration and Implant Supported prothesis" FCU-URJC, kteří splňují kritéria pro zařazení a souhlasí s účastí ve studii.

Kritéria pro přijetí byla následující: věk 18 nebo více let, bez předchozí anamnézy parodontologického ošetření v posledních šesti měsících a bez lékařské nebo zubní anamnézy, která by mohla kontraindikovat parodontální léčbu. Kritéria vyloučení zahrnovala současné těhotenství nebo kojení, imunologické poruchy, periodontální léčbu během posledních 6 měsíců, perorální antikoncepci a užívání antibiotik během posledních 3 měsíců, infekce (jako je HIV, hepatitida a tuberkulóza). Kromě toho byly zuby třetího moláru vyloučeny z odběru vzorků GCF, protože byly často zasaženy nebo extrahovány

Kuřáci nebudou vyloučeni a budou klasifikováni jako slabí kuřáci (méně než 10 cigaret/den) nebo silní kuřáci (více než 10 cigaret/den).

Diabetičtí pacienti také nebudou vyloučeni, ale budou identifikováni a zohledněni.

Všichni pacienti zařazení do studie projdou následujícími fázemi:

1. Kompletní parodontologické vyšetření (hloubka sondy (PD), úroveň klinického přilnutí (CAL), index plaku (PI), sondování krve (BOP)).

2. Pacienti budou rozděleni do dvou skupin:

   • 30 zdravých pacientů (kontrola)
   • 30 pacientů s parodontózou (test- paradentóza stadium I-II (15 pacientů), paradentóza stadium III-IV (15 pacientů).

Kvůli nedostatku studií in vivo byl proveden jednoduchý výpočet velikosti vzorku pomocí konzervativní analýzy výkonu (program G*Power 3.1.9.4, 2009). Jednoduchá velikost (27 subjektů) byla založena na dvoustranném testu s efektivní velikostí 0,05, pravděpodobností abecední chyby 0,05, rozdíl ve střední hodnotě 50 %, standardní odchylky měly být maximálně 80 % středních hodnot a síla 0,90.

S přihlédnutím k těmto parametrům se odhaduje jednoduchá velikost vzorku mezi 21-30 pacienty na skupinu.

Vzorky crevikulární tekutiny budou také získány podle protokolu výrobce s použitím perio papírů (Periopaper, Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Zuby, které mají být vyšetřeny, budou izolovány bavlněnými smotky a vysušeny na vzduchu. Papírové proužky budou zavedeny do gingiválního sulku přibližně na 30 sekund. Vzorky pacientů testovací skupiny budou odebrány z periodontálně patogenních lokalit a zdravých lokalit. Silně kontaminované vzorky slinami nebo krví budou zlikvidovány.

Vzorky budou skladovány při -80 C v laboratoři Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Edificio Departamental I, Fundación Clínica Universitaria, URJC (Alcorcon). Jakmile budou získány všechny vzorky, bude provedena ELISA analýza všech vzorků s použitím specifické ELISA soupravy komerčně dostupné pro lidský LL-37 (HyCult Biotechnology, Uden, Nizozemsko) a komerčně dostupných souprav pro IL-4, IL-4, IL. -6 a IL-10 ((Diaclone SAS; Besançon, Francie; 850.890, 950.035 a 850.880, v tomto pořadí).

Pacienti testovací skupiny po prvním odběru vzorku absolvují kurz základního parodontologického ošetření (odlupování a hoblování kořenů) a instrukce o ústní hygieně.

Za 4–6 týdnů se uskuteční schůzka s přehodnocením, kde budou odebrány nové vzorky crevikulární tekutiny z obou skupin (test a kontrola), aby se vyhodnotil jakýkoli statisticky významný rozdíl s ohledem na množství LL-37 ve vztahu k výchozí hodnotě. zaznamenaná měření. Poté budou vzorky znovu zkontrolovány provedením testů ELISA podle výše popsaného protokolu.

Jakmile budou získány všechny výsledky, provede se statistická analýza vzorků.