Il ruolo delle citochine antinfiammatorie e dei biomarcatori del peptide antimicrobico LL-37 nel trattamento della malattia parodontale.

"Il ruolo delle citochine antinfiammatorie e dei biomarcatori del peptide antimicrobico LL-37 nel trattamento della malattia parodontale".

1. introduzione

   La malattia parodontale è un processo infettivo che consiste nella distruzione delle strutture anatomiche di sostegno del dente, come conseguenza della risposta infiammatoria all'attività periopatogena della placca batterica sottogengivale, che porta ad una risposta immunitaria innata, infiammatoria e adattativa.

   La manifestazione clinica della malattia dipende dall'ospite e da fattori ambientali, nonché dallo specifico agente microbiologico coinvolto. L'interrelazione tra i batteri ei meccanismi di immunodifesa dell'ospite costituiscono la base dei meccanismi immunopatologici che portano alla malattia. In condizioni sane, esiste un equilibrio tra l'attività del microbiota parodontale e la risposta immunitaria dell'ospite.

   Nel sistema di difesa innato del cavo orale sono coinvolti diversi peptidi antimicrobici, uno dei quali è la catelicidina umana LL-37.

   L'attività di peptidi antimicrobici come LL-37 nel solco gengivale è considerata uno dei maggiori meccanismi di difesa del parodonto. L'epitelio gengivale non solo costituisce una barriera fisica per evitare l'invasione batterica. I neutrofili migrano verso l'epitelio giunzionale e creano una barriera tra la placca batterica e l'epitelio sottostante. Producono anche peptidi antimicrobici, uno dei quali è il 18 kDa (hCAP18). Una volta che i neutrofili sono attivati ​​in risposta all'aggressione batterica rilasciano LL-37, con un'attività simile ad un antibiotico ad ampio spettro.

   La totale assenza di questo peptide (LL-37) è stata associata a parodontite aggressiva, in particolare nei pazienti con carenza di neutrofili come quelli che soffrono della sindrome di Morfan Kosmann

   La natura di questa ricerca mira a chiarire il ruolo di LL-37 nella malattia parodontale confrontando l'uso di una tecnica non invasiva come campioni di fluido crevicolare in pazienti che soffrono di malattia parodontale, prima e dopo aver ricevuto un ciclo di trattamento parodontale di base (radice ridimensionamento e piallatura). Oltre a quanto sopra, saranno valutate anche le citochine pro e antinfiammatorie (IL-6, IL-4, IL-10 in particolare) prima e dopo il trattamento parodontale. I campioni ottenuti saranno analizzati mediante analisi immunoistochimica (ELISA). La quantificazione di LL-37 prima e dopo il trattamento parodontale associata ai risultati clinici osservati può servire come biomarcatore diagnostico della risposta immunopatologica inerente alla malattia parodontale.

2. Giustificazione della domanda di ricerca. Stato attuale

   Negli ultimi anni è stato compiuto un grande sforzo da parte della comunità scientifica per cercare di comprendere i complessi processi immunopatologici legati alla malattia parodontale e la relazione tra l'attività del microbiota parodontale e i meccanismi di difesa dell'ospite.

   La rilevanza di questa ricerca può servire a comprendere più in dettaglio il ruolo del peptide antimicrobico LL-37 nella malattia parodontale non solo a causa del loro effetto battericida ma nella modulazione della risposta immunologica dell'ospite e della sua attività prima e dopo il trattamento parodontale . La mancanza di studi su questo argomento riflette la necessità di ulteriori ricerche su questo argomento.

   In definitiva, i risultati di questa ricerca potrebbero costituire la base di un nuovo approccio terapeutico basato sull'uso di LL-37 per aiutare a modulare la risposta immunologica dell'ospite in combinazione con il trattamento parodontale convenzionale. Ciò può essere particolarmente rilevante nei pazienti suscettibili di sviluppare malattie parodontali o perimplantari o in casi particolari che sono resistenti alle alternative terapeutiche convenzionali.

3. Sintesi della ricerca prevista

Lo scopo principale dello studio è quello di indagare il ruolo di LL-37 nella risposta immunopatologica del parodonto. Gli obiettivi successivi sono di indagare la possibilità di utilizzare questo peptide microbico per servire come agente diagnostico, prognostico e terapeutico nel trattamento della malattia parodontale.

Ipotesi di ricerca: Esistono significative differenze quantitative nei livelli di LL-37 prima e dopo il trattamento parodontale, con una significativa riduzione di LL-37 alla rivalutazione (4-6 settimane dopo un ciclo di trattamento parodontale di base - scaling e levigatura radicolare ).

Ipotesi nulla: non ci sono differenze quantitative significative nei livelli di LL-37 prima e dopo il trattamento parodontale

Gli obiettivi del presente studio sono:

1. Determinare se i pazienti sani e i pazienti con malattia parodontale hanno diversi livelli di LL-37, IL-6, IL-4 e IL-10 nel liquido crevicolare al basale e correlarli allo stadio/gravità della malattia parodontale.
2. Valutare se dopo un ciclo di trattamento parodontale di base questi livelli di LL-37, IL-6, IL-4 e IL-10 al basale sono simili ai livelli quantificati su pazienti sani al basale.
3. Per quanto riguarda i campioni di fluido crevicolare, valutare se i livelli di LL-37, IL-6, IL-4 e IL-10 nei denti affetti da malattia parodontale differiscono dai siti sani sullo stesso individuo o se non vi sono differenze significative nei suddetti prima e dopo un ciclo di trattamento parodontale.
4. Stabilire un protocollo non invasivo per valutare lo stato immunologico del paziente prima e dopo il trattamento parodontale come fattore prognostico.

4. Materiali e metodi

È stata concessa l'approvazione etica del Comitato Etico dell'Università Rey Juan Carlos di Madrid (URJC). Verrà effettuata una selezione di pazienti del "Master in Implantologia avanzata, rigenerazione dei tessuti e protesi supportate da impianti" della FCU-URJC che soddisfano i criteri di inclusione e che acconsentono a far parte dello studio.

I criteri per l'ingresso erano i seguenti: età pari o superiore a 18 anni, senza precedenti di trattamento parodontale negli ultimi sei mesi e senza anamnesi medica o dentale che potesse controindicare il trattamento parodontale. I criteri di esclusione includevano gravidanza o allattamento in corso, disturbi immunologici, trattamento parodontale negli ultimi 6 mesi, contraccezione orale e uso di antibiotici negli ultimi 3 mesi, infezioni (come HIV, epatite e tubercolosi). Inoltre, i terzi denti molari sono stati esclusi dal campionamento GCF per essere spesso inclusi o estratti

I pazienti fumatori non saranno esclusi e saranno classificati come fumatori leggeri (meno di 10 sigarette/giorno) o forti fumatori (più di 10 sigarette/giorno).

Anche i pazienti diabetici non saranno esclusi ma saranno identificati e presi in considerazione.

Tutti i pazienti inclusi nello studio passeranno attraverso le seguenti fasi:

1. Esame parodontale completo (profondità di sondaggio (PD), livello di attacco clinico (CAL), indice di placca (PI), sangue al sondaggio (BOP)).

2. I pazienti saranno divisi in due gruppi:

   • 30 pazienti sani (controllo)
   • 30 pazienti parodontali (test-parodontite stadio I-II (15 pazienti), parodontite stadio III-IV (15 pazienti).

A causa della mancanza di studi in vivo, è stato effettuato un semplice calcolo della dimensione del campione utilizzando un'analisi di potenza conservativa (programma G*Power 3.1.9.4, 2009). La dimensione semplice (27 soggetti) era basata su un test a due code con una dimensione effettiva di 0,05, una probabilità di errore alfabetico di 0,05, una differenza del 50% nel valore medio, deviazioni standard al massimo dell'80% dei valori medi e un potenza di 0,90.

Tenendo conto di questi parametri, si stima una dimensione del campione semplice tra 21-30 pazienti per gruppo.

Saranno inoltre ottenuti campioni di fluido crevicolare seguendo il protocollo del produttore utilizzando carte perio (Periopaper, Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). I denti da esaminare saranno isolati con rulli di cotone e asciugati all'aria. Strisce di carta verranno introdotte nel solco gengivale per circa 30 secondi. I campioni dei pazienti del gruppo di test saranno prelevati da siti parodontalmente patogeni e da siti sani. I campioni fortemente contaminati con saliva o sangue verranno scartati.

I campioni saranno conservati a -80 C presso il laboratorio del Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Edificio Departamental I, Fundación Clínica Universitaria, URJC (Alcorcon). Una volta ottenuti tutti i campioni, l'analisi ELISA di tutti i campioni verrà eseguita utilizzando un kit ELISA specifico disponibile in commercio per LL-37 umano (HyCult Biotechnology, Uden, Paesi Bassi) e kit disponibili in commercio per IL-4, IL-4, IL -6 e IL-10 ((Diaclone SAS; Besançon, Francia; 850.890, 950.035 e 850.880, rispettivamente).

I pazienti del gruppo di test riceveranno un corso di trattamento parodontale di base (detartrasi radicolare e levigatura) e istruzioni per l'igiene orale dopo la prima raccolta del campione.

Verrà effettuato un appuntamento di rivalutazione a 4-6 settimane in cui verranno prelevati nuovi campioni di fluido crevicolare di entrambi i gruppi (test e controllo), per valutare eventuali differenze statisticamente significative rispetto alla quantità di LL-37 rispetto al basale misurazioni registrate. Successivamente, i campioni verranno nuovamente esaminati eseguendo saggi ELISA seguendo il protocollo sopra descritto.

Una volta ottenuti tutti i risultati, verrà effettuata l'analisi statistica dei campioni.