Rola cytokin przeciwzapalnych i biomarkerów przeciwdrobnoustrojowych peptydu LL-37 w leczeniu chorób przyzębia.

„Rola cytokin przeciwzapalnych i biomarkerów przeciwdrobnoustrojowych peptydu LL-37 w leczeniu chorób przyzębia”.

1. Wstęp

   Choroba przyzębia jest procesem zakaźnym, który polega na zniszczeniu podtrzymujących struktur anatomicznych zęba, w wyniku odpowiedzi zapalnej na okołopatogenne działanie poddziąsłowej płytki bakteryjnej, co prowadzi do wrodzonej, zapalnej i nabytej odpowiedzi immunologicznej.

   Kliniczna manifestacja choroby zależy od gospodarza i czynników środowiskowych, jak również od konkretnego zaangażowanego czynnika mikrobiologicznego. Wzajemne powiązania między bakteriami i mechanizmami obrony immunologicznej gospodarza stanowią podstawę mechanizmów immunopatologicznych prowadzących do choroby. W zdrowych warunkach istnieje równowaga między aktywnością mikrobioty przyzębia a odpowiedzią immunologiczną gospodarza.

   We wrodzonym systemie obronnym jamy ustnej zaangażowanych jest kilka peptydów przeciwdrobnoustrojowych, wśród których znajduje się ludzka katelicydyna LL-37.

   Aktywność peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak LL-37, w bruździe dziąsłowej uważana jest za jeden z największych mechanizmów obronnych przyzębia. Nabłonek dziąseł nie tylko stanowi fizyczną barierę chroniącą przed inwazją bakterii. Neutrofile migrują do nabłonka łączącego i tworzą barierę między płytką bakteryjną a leżącym pod nią nabłonkiem. Wytwarzają również peptydy przeciwdrobnoustrojowe, z których jeden ma 18 kDa (hCAP18). Kiedy neutrofile są aktywowane w odpowiedzi na agresję bakteryjną, uwalniają LL-37, o działaniu podobnym do antybiotyku o szerokim spektrum działania.

   Całkowity brak tego peptydu (LL-37) został powiązany z agresywnym zapaleniem przyzębia, w szczególności u pacjentów z niedoborem neutrofili, takich jak ci, którzy cierpią na zespół Morfana Kosmanna

   Charakter tych badań ma na celu wyjaśnienie roli LL-37 w chorobach przyzębia poprzez porównanie stosowania nieinwazyjnej techniki, takiej jak próbki płynu dziąsłowego u pacjentów cierpiących na choroby przyzębia, przed i po przejściu podstawowego leczenia periodontologicznego (korzeniowego skalowanie i struganie). Oprócz powyższego zostaną również ocenione cytokiny pro i przeciwzapalne (w szczególności IL-6, IL-4, IL-10) przed i po leczeniu periodontologicznym. Uzyskane próbki zostaną poddane analizie metodą analizy immunohistochemicznej (ELISA). Kwantyfikacja LL-37 przed i po leczeniu periodontologicznym związana z obserwowanymi objawami klinicznymi może służyć jako diagnostyczny biomarker odpowiedzi immunologicznej właściwej dla choroby przyzębia.

2. Uzasadnienie pytania badawczego. Aktualny stan

   W ostatnich latach społeczność naukowa dołożyła wszelkich starań, aby zrozumieć złożone procesy immunopatologiczne związane z chorobami przyzębia oraz związek między aktywnością mikroflory przyzębia a mechanizmami obronnymi gospodarza.

   Znaczenie tych badań może posłużyć do dokładniejszego zrozumienia roli przeciwdrobnoustrojowego peptydu LL-37 w chorobach przyzębia nie tylko ze względu na ich działanie bakteriobójcze, ale także na modulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza i jego aktywność przed i po leczeniu periodontologicznym . Brak opracowań na ten temat świadczy o potrzebie dalszych badań na ten temat.

   Ostatecznie wyniki tych badań mogą stanowić podstawę nowego podejścia terapeutycznego opartego na wykorzystaniu LL-37 do pomocy w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza w połączeniu z konwencjonalnym leczeniem periodontologicznym. Może to być szczególnie istotne u pacjentów podatnych na rozwój chorób przyzębia lub chorób okołoimplantowych lub w szczególnych przypadkach, którzy są oporni na konwencjonalne alternatywne metody leczenia.

3. Podsumowanie zamierzonych badań

Głównym celem pracy jest zbadanie roli LL-37 w odpowiedzi immunopatologicznej przyzębia. Kolejnym celem jest zbadanie możliwości wykorzystania tego peptydu mikrobiologicznego jako środka diagnostycznego, prognostycznego oraz terapeutycznego w leczeniu chorób przyzębia.

Hipoteza badawcza: Istnieją znaczne różnice ilościowe w poziomach LL-37 przed i po leczeniu periodontologicznym, przy czym przy ponownej ocenie (4-6 tygodni po kursie podstawowego leczenia periodontologicznego - scalingu i strugania) ).

Hipoteza zerowa: Nie ma istotnych różnic ilościowych w poziomach LL-37 przed i po leczeniu periodontologicznym

Celem niniejszego badania jest:

1. Ustalić, czy zdrowi pacjenci i pacjenci z chorobą przyzębia mają różne wyjściowe poziomy LL-37, IL-6, IL-4 i IL-10 w płynie szczelinowym i powiązać je ze stopniem zaawansowania choroby przyzębia.
2. Ocenić, czy po cyklu podstawowego leczenia periodontologicznego te wyjściowe poziomy LL-37, IL-6, IL-4 i IL-10 są podobne do ilościowych poziomów u zdrowych pacjentów na początku badania.
3. W odniesieniu do próbek płynu dziąsłowego ocenić, czy poziomy LL-37, IL-6, IL-4 i IL-10 w zębach dotkniętych chorobą przyzębia różnią się od zdrowych miejsc u tej samej osoby lub czy nie ma istotnych różnic w ww. przed i po cyklu leczenia periodontologicznego.
4. Ustalić nieinwazyjny protokół oceny stanu immunologicznego pacjenta przed i po leczeniu periodontologicznym jako czynnika prognostycznego.

4. Materiał i metody

Uzyskano aprobatę etyczną Komisji Etycznej Uniwersytetu Rey Juan Carlos w Madrycie (URJC). Dokonany zostanie wybór pacjentów „Master in Advanced Implantology, Regeneration Tissue and Implant Supported Prothesis” FCU-URJC, którzy spełniają kryteria włączenia i wyrażają zgodę na udział w badaniu.

Kryteriami włączenia były: ukończone 18 lat, brak historii leczenia periodontologicznego w ciągu ostatnich sześciu miesięcy oraz brak historii medycznej lub stomatologicznej, która mogłaby stanowić przeciwwskazanie do leczenia periodontologicznego. Kryteria wykluczenia obejmowały obecną ciążę lub laktację, zaburzenia immunologiczne, leczenie przyzębia w ciągu ostatnich 6 miesięcy, doustną antykoncepcję i stosowanie antybiotyków w ciągu ostatnich 3 miesięcy, infekcje (takie jak HIV, zapalenie wątroby i gruźlica). Ponadto trzecie zęby trzonowe zostały wykluczone z pobierania próbek GCF ze względu na częste uderzanie lub ekstrakcję

Pacjenci palący nie będą wykluczeni i zostaną sklasyfikowani jako palacze mało palący (mniej niż 10 papierosów dziennie) lub nałogowi palacze (więcej niż 10 papierosów dziennie).

Pacjenci z cukrzycą również nie zostaną wykluczeni, ale zostaną zidentyfikowani i uwzględnieni.

Wszyscy pacjenci włączeni do badania przejdą przez następujące etapy:

1. Pełne badanie periodontologiczne (głębokość zgłębnika (PD), kliniczny poziom przyczepu (CAL), wskaźnik płytki nazębnej (PI), krew na zgłębniku (BOP)).

2. Pacjenci zostaną podzieleni na dwie grupy:

   • 30 zdrowych pacjentów (kontrola)
   • 30 pacjentów z chorobami przyzębia (badanie – zapalenie przyzębia I-II stopnia (15 pacjentów), zapalenie przyzębia stopnia III-IV (15 pacjentów).

Ze względu na brak badań in vivo przeprowadzono proste obliczenie wielkości próby przy użyciu konserwatywnej analizy mocy (program G*Power 3.1.9.4, 2009). Prosty rozmiar (27 osób) został oparty na dwustronnym teście z efektywnym rozmiarem 0,05, prawdopodobieństwem błędu alfabetycznego 0,05, różnicą 50% wartości średniej, odchyleniami standardowymi wynoszącymi maksymalnie 80% wartości średnich i moc 0,90.

Biorąc pod uwagę te parametry, szacuje się prostą wielkość próby między 21-30 pacjentów na grupę.

Próbki płynu dziąsłowego będą również pobierane zgodnie z protokołem producenta przy użyciu papierów perio (Periopaper, Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Badane zęby zostaną odizolowane za pomocą wacików i wysuszone na powietrzu. Paski papieru zostaną wprowadzone do bruzdy dziąsłowej na około 30 sekund. Próbki pacjentów z grupy badanej będą pobierane z miejsc patogennych dla przyzębia iz miejsc zdrowych. Silnie zanieczyszczone próbki śliną lub krwią zostaną odrzucone.

Próbki będą przechowywane w temperaturze -80 C w laboratorium Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Edificio Departamental I, Fundación Clínica Universitaria, URJC (Alcorcon). Po uzyskaniu wszystkich próbek zostanie przeprowadzona analiza ELISA wszystkich próbek przy użyciu specjalnego zestawu ELISA dostępnego na rynku dla ludzkiego LL-37 (HyCult Biotechnology, Uden, Holandia) i dostępnych na rynku zestawów dla IL-4, IL-4, IL -6 i IL-10 ((Diaclone SAS; Besançon, Francja; odpowiednio 850.890, 950.035 i 850.880).

Pacjenci z grupy badanej otrzymają kurs podstawowego leczenia periodontologicznego (scaling i struganie korzeni) oraz instruktaż higieny jamy ustnej po pierwszym pobraniu próbki.

Po 4-6 tygodniach odbędzie się wizyta kontrolna, podczas której zostaną pobrane nowe próbki płynu dziąsłowego z obu grup (badana i kontrolna), w celu oceny wszelkich statystycznie istotnych różnic w odniesieniu do ilości LL-37 w stosunku do wartości wyjściowej zarejestrowane pomiary. Następnie próbki zostaną ponownie zbadane, wykonując testy ELISA zgodnie z protokołem opisanym powyżej.

Po uzyskaniu wszystkich wyników zostanie przeprowadzona analiza statystyczna próbek.