O papel das citocinas antiinflamatórias e dos biomarcadores do peptídeo antimicrobiano LL-37 no tratamento da doença periodontal.

'O papel das citocinas anti-inflamatórias e dos biomarcadores do peptídeo antimicrobiano LL-37 no tratamento da doença periodontal.

1. Introdução

   A doença periodontal é um processo infeccioso que consiste na destruição das estruturas anatômicas de suporte do dente, como consequência da resposta inflamatória à atividade periopatogênica da placa bacteriana subgengival, que leva a uma resposta imune inata, inflamatória e adaptativa.

   A manifestação clínica da doença depende do hospedeiro e de fatores ambientais, bem como do agente microbiológico específico envolvido. A inter-relação entre as bactérias e os mecanismos de imunodefesa do hospedeiro constituem a base dos mecanismos imunopatológicos que levam à doença. Em condições saudáveis, há um equilíbrio entre a atividade da microbiota periodontal e a resposta imune do hospedeiro.

   No sistema de defesa inato da cavidade oral estão envolvidos vários peptídeos antimicrobianos, sendo um deles a catelicidina humana LL-37.

   A atividade de peptídeos antimicrobianos como o LL-37 no sulco gengival é considerada um dos maiores mecanismos de defesa do periodonto. O epitélio gengival não constitui apenas uma barreira física para evitar a invasão bacteriana. Os neutrófilos migram para o epitélio juncional e criam uma barreira entre a placa bacteriana e o epitélio subjacente. Também produzem peptídeos antimicrobianos, um deles o de 18 kDa (hCAP18). Uma vez que os neutrófilos são ativados em resposta à agressão bacteriana, eles liberam LL-37, com atividade semelhante a um antibiótico de amplo espectro.

   A ausência total deste peptídeo (LL-37) tem sido associada à periodontite agressiva, em particular em pacientes com deficiência de neutrófilos, como os que sofrem da síndrome de Morfan Kosmann

   A natureza desta pesquisa visa elucidar o papel do LL-37 na doença periodontal, comparando o uso de uma técnica não invasiva, como amostras de fluido crevicular em pacientes que sofrem de doença periodontal, antes e depois de receber um curso de tratamento periodontal básico (raiz dimensionamento e aplainamento). Além do exposto, citocinas pró e antiinflamatórias (IL-6, IL-4, IL-10 em particular) também serão avaliadas antes e após o tratamento periodontal. As amostras obtidas serão analisadas por análise imuno-histoquímica (ELISA). A quantificação de LL-37 antes e após o tratamento periodontal associada aos achados clínicos observados pode servir como biomarcador diagnóstico da resposta imunopatológica inerente à doença periodontal.

2. Justificativa da questão de pesquisa. Status atual

   Nos últimos anos, um grande esforço da comunidade científica tem sido feito para tentar entender os complexos processos imunopatológicos relacionados à doença periodontal e a relação entre a atividade da microbiota periodontal e os mecanismos de defesa do hospedeiro.

   A relevância desta pesquisa pode servir para entender com mais detalhes o papel do peptídeo antimicrobiano LL-37 na doença periodontal não apenas devido ao seu efeito bactericida, mas na modulação da resposta imunológica do hospedeiro e sua atividade antes e após o tratamento periodontal . A escassez de estudos sobre o assunto reflete a necessidade de mais pesquisas sobre o tema.

   Em última análise, os resultados desta pesquisa podem formar a base de uma nova abordagem terapêutica baseada no uso de LL-37 para ajudar a modular a resposta imunológica do hospedeiro em combinação com o tratamento periodontal convencional. Isso pode ser particularmente relevante em pacientes suscetíveis a desenvolver doenças periodontais ou periimplantares ou em casos particulares que são resistentes a alternativas convencionais de tratamento.

3. Resumo da pesquisa pretendida

O principal objetivo do estudo é investigar o papel do LL-37 na resposta imunopatológica do periodonto. Os objetivos subsequentes são investigar a possibilidade de usar este peptídeo microbiano para servir como agente diagnóstico, prognóstico e terapêutico no tratamento da doença periodontal.

Hipótese de pesquisa: Existem diferenças quantitativas significativas nos níveis de LL-37 antes e depois do tratamento periodontal, com uma redução significativa de LL-37 na reavaliação (4-6 semanas após um curso de tratamento periodontal básico - raspagem e alisamento radicular ).

Hipótese nula: Não há diferenças quantitativas significativas nos níveis de LL-37 antes e depois do tratamento periodontal

Os objetivos do presente estudo são:

1. Determinar se pacientes saudáveis ​​e pacientes com doença periodontal têm níveis diferentes de LL-37, IL-6, IL-4 e IL-10 no fluido crevicular na linha de base e relacioná-los ao estágio/gravidade da doença periodontal.
2. Avalie se após um curso de tratamento periodontal básico esses níveis de LL-37, IL-6, IL-4 e IL-10 na linha de base são semelhantes aos níveis quantificados em pacientes saudáveis ​​na linha de base.
3. Com relação às amostras de fluido crevicular, avaliar se os níveis de LL-37, IL-6, IL-4 e IL-10 em dentes afetados pela doença periodontal diferem dos locais saudáveis ​​no mesmo indivíduo ou se não há diferenças significativas nos anteriores antes e depois de um curso de tratamento periodontal.
4. Estabelecer um protocolo não invasivo para avaliar o estado imunológico do paciente antes e depois do tratamento periodontal como fator prognóstico.

4. Material e métodos

A aprovação ética do Comitê de Ética da Universidade Rey Juan Carlos de Madri (URJC) foi concedida. Será feita uma seleção dos pacientes do "Mestrado em Implantodontia Avançada, Regeneração Tecidual e Prótese Implantossuportada" da FCU-URJC que preencham os critérios de inclusão e que consintam em fazer parte do estudo.

Os critérios de inclusão foram os seguintes: idade igual ou superior a 18 anos, sem história prévia de tratamento periodontal nos últimos seis meses e sem história médica ou odontológica que pudesse contra-indicar o tratamento periodontal. Os critérios de exclusão incluíram gravidez ou lactação atual, distúrbios imunológicos, tratamento periodontal nos últimos 6 meses, contracepção oral e uso de antibióticos nos últimos 3 meses, infecções (como HIV, hepatite e tuberculose). Além disso, os terceiros molares foram excluídos da amostragem GCF por serem frequentemente impactados ou extraídos

Pacientes fumantes não serão excluídos e serão classificados como fumantes leves (menos de 10 cigarros/dia) ou fumantes pesados ​​(mais de 10 cigarros/dia).

Os pacientes diabéticos também não serão excluídos, mas serão identificados e contabilizados.

Todos os pacientes incluídos no estudo passarão pelas seguintes etapas:

1. Exame periodontal completo (profundidade de sondagem (PD), nível de inserção clínica (CAL), índice de placa (PI), sangue à sondagem (BOP)).

2. Os pacientes serão divididos em dois grupos:

   • 30 pacientes saudáveis ​​(controle)
   • 30 pacientes periodontais (teste-periodontite estágio I-II (15 pacientes), periodontite estágio III-IV (15 pacientes).

Devido à falta de estudos in vivo, o cálculo simples do tamanho da amostra foi feito usando uma análise de poder conservadora (programa G*Power 3.1.9.4, 2009). O tamanho simples (27 indivíduos) foi baseado em um teste bicaudal com um tamanho efetivo de 0,05, uma probabilidade de erro alfabético de 0,05, diferença de 50% no valor médio, desvios padrão de no máximo 80% dos valores médios e um potência de 0,90.

Levando em consideração esses parâmetros, estima-se um tamanho de amostra simples entre 21-30 pacientes por grupo.

Amostras de fluido crevicular também serão obtidas seguindo o protocolo do fabricante usando papéis perio (Periopaper, Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Os dentes a serem examinados serão isolados com rolos de algodão e secos ao ar. Tiras de papel serão introduzidas no sulco gengival por aproximadamente 30 segundos. As amostras dos pacientes do grupo de teste serão retiradas de locais patogênicos periodontais e locais saudáveis. Amostras fortemente contaminadas com saliva ou sangue serão descartadas.

As amostras serão armazenadas a -80 C no laboratório do Departamento de Ciências Básicas de la Salud, Edifício Departamental I, Fundação Clínica Universitária, URJC (Alcorcon). Assim que todas as amostras forem obtidas, a análise ELISA de todas as amostras será realizada usando um kit ELISA específico comercialmente disponível para humano LL-37 (HyCult Biotechnology, Uden, Holanda) e kits comercialmente disponíveis para IL-4, IL-4, IL -6 e IL-10 ((Diaclone SAS; Besançon, França; 850.890, 950.035 e 850.880, respectivamente).

Os pacientes do grupo teste receberão um curso de tratamento periodontal básico (raspagem e alisamento radicular) e instruções de higiene bucal após a primeira coleta de amostra.

Será realizada uma consulta de reavaliação em 4-6 semanas onde serão obtidas novas amostras de fluido crevicular de ambos os grupos (teste e controle), para avaliar qualquer diferença estatisticamente significativa com relação à quantidade de LL-37 em relação à linha de base medidas registradas. Depois disso, as amostras serão examinadas novamente por meio da realização de ensaios ELISA seguindo o protocolo descrito acima.

Uma vez obtidos todos os resultados, será realizada a análise estatística das amostras.