Роль противовоспалительных цитокинов и антимикробных биомаркеров пептида LL-37 в лечении заболеваний пародонта.

«Роль противовоспалительных цитокинов и антимикробных биомаркеров пептида LL-37 в лечении заболеваний пародонта.

1. Вступление

   Пародонтоз – инфекционный процесс, заключающийся в разрушении опорных анатомических структур зуба, как следствие воспалительной реакции на периопатогенную активность поддесневого бактериального налета, что приводит к врожденному, воспалительному и адаптивному иммунному ответу.

   Клинические проявления болезни зависят от хозяина и факторов окружающей среды, а также от конкретного вовлеченного микробиологического агента. Взаимосвязь между бактериями и механизмами иммунозащиты хозяина составляют основу иммунопатологических механизмов, приводящих к заболеванию. В здоровых условиях существует баланс между активностью микробиоты пародонта и иммунным ответом хозяина.

   Во врожденной защитной системе полости рта участвуют несколько антимикробных пептидов, одним из которых является человеческий кателицидин LL-37.

   Активность противомикробных пептидов, таких как LL-37, в десневой борозде считается одним из сильнейших защитных механизмов периодонта. Эпителий десны не только представляет собой физический барьер, предотвращающий бактериальную инвазию. Нейтрофилы мигрируют в соединительный эпителий и создают барьер между бактериальной бляшкой и нижележащим эпителием. Они также производят противомикробные пептиды, один из которых 18 кДа (hCAP18). Как только нейтрофилы активируются в ответ на бактериальную агрессию, высвобождается LL-37 с активностью, аналогичной антибиотику широкого спектра действия.

   Полное отсутствие этого пептида (LL-37) было связано с агрессивным пародонтитом, в частности, у пациентов с дефицитом нейтрофилов, таких как те, кто страдает синдромом Морфана-Косманна.

   Характер этого исследования направлен на выяснение роли LL-37 в заболеваниях пародонта путем сравнения использования неинвазивной техники, такой как образцы щелевой жидкости, у пациентов, страдающих пародонтитом, до и после прохождения курса базового лечения пародонта (корневой масштабирование и планирование). В дополнение к вышесказанному, про- и противовоспалительные цитокины (в частности, IL-6, IL-4, IL-10) также будут оцениваться до и после пародонтологического лечения. Полученные образцы будут проанализированы с помощью иммуногистохимического анализа (ИФА). Количественное определение LL-37 до и после пародонтологического лечения, связанное с наблюдаемыми клиническими данными, может служить диагностическим биомаркером иммунопатологического ответа, присущего пародонтальному заболеванию.

2. Обоснование исследовательского вопроса. Текущий статус

   В последние годы научное сообщество приложило большие усилия, чтобы попытаться понять сложные иммунопатологические процессы, связанные с заболеваниями пародонта, и взаимосвязь между активностью пародонтальной микробиоты и защитными механизмами хозяина.

   Актуальность данного исследования может послужить для более детального понимания роли антимикробного пептида LL-37 в заболеваниях пародонта не только из-за их бактерицидного действия, но и в модуляции иммунологического ответа хозяина и его активности до и после пародонтологического лечения. . Отсутствие исследований по этому вопросу отражает необходимость дальнейших исследований по этой теме.

   В конечном счете, результаты этого исследования могут лечь в основу нового терапевтического подхода, основанного на использовании LL-37, чтобы помочь модулировать иммунологический ответ хозяина в сочетании с традиционным пародонтологическим лечением. Это может быть особенно актуально для пациентов, предрасположенных к развитию заболеваний пародонта или периимплантационных заболеваний, или в особых случаях, которые устойчивы к традиционным альтернативным методам лечения.

3. Резюме предполагаемого исследования

Основной целью исследования является изучение роли LL-37 в иммунопатологическом ответе пародонта. Последующие цели состоят в том, чтобы исследовать возможность использования этого микробного пептида в качестве диагностического, прогностического, а также терапевтического средства при лечении пародонтита.

Гипотеза исследования: существуют значительные количественные различия в уровнях LL-37 до и после пародонтологического лечения со значительным снижением LL-37 при повторной оценке (через 4-6 недель после курса базисного пародонтологического лечения - скейлинга и полировки корней). ).

Нулевая гипотеза: нет существенных количественных различий в уровнях LL-37 до и после пародонтологического лечения.

Целями настоящего исследования являются:

1. Определите, имеют ли здоровые пациенты и пациенты с заболеванием пародонта разные уровни LL-37, IL-6, IL-4 и IL-10 в десневой жидкости на исходном уровне и соотносят их со стадией/тяжестью заболевания пародонта.
2. Оцените, являются ли исходные уровни LL-37, IL-6, IL-4 и IL-10 после курса базового пародонтологического лечения сходными с исходными количественными уровнями у здоровых пациентов.
3. Что касается образцов десневой жидкости, оцените, отличаются ли уровни LL-37, IL-6, IL-4 и IL-10 в зубах, пораженных пародонтозом, по сравнению со здоровыми участками одного и того же человека, или нет существенных различий в вышеуказанных показателях. до и после курса пародонтологического лечения.
4. Разработать неинвазивный протокол для оценки иммунологического статуса пациента до и после пародонтологического лечения как прогностического фактора.

4. Материал и методы

Получено одобрение этического комитета Мадридского университета имени Рея Хуана Карлоса (URJC). Будет проведен отбор пациентов «Магистра в области продвинутой имплантологии, регенерации тканей и протезов с опорой на имплантаты» FCU-URJC, которые соответствуют критериям включения и которые дали согласие на участие в исследовании.

Критерии включения были следующими: возраст 18 лет и старше, отсутствие в анамнезе лечения пародонтита за последние шесть месяцев, а также отсутствие истории болезни или стоматологического анамнеза, которые могли бы служить противопоказанием для пародонтологического лечения. Критерии исключения включали текущую беременность или лактацию, иммунологические нарушения, пародонтологическое лечение в течение последних 6 месяцев, оральные контрацептивы и прием антибиотиков в течение последних 3 месяцев, инфекции (такие как ВИЧ, гепатит и туберкулез). Кроме того, третьи моляры были исключены из выборки GCF из-за частого ретинирования или удаления.

Пациенты-курильщики не будут исключены и будут классифицированы как малокурящие (менее 10 сигарет в день) или заядлые курильщики (более 10 сигарет в день).

Больные диабетом также не будут исключены, но будут выявлены и учтены.

Все пациенты, включенные в исследование, проходят следующие этапы:

1. Полное пародонтальное обследование (глубина зондирования (PD), уровень клинического прикрепления (CAL), индекс зубного налета (PI), кровь при зондировании (BOP)).

2. Пациенты будут разделены на две группы:

   • 30 здоровых пациентов (контроль)
   • 30 пациентов с пародонтитом (тест- пародонтит I-II стадии (15 больных), пародонтит III-IV стадии (15 больных).

Из-за отсутствия исследований in vivo был выполнен простой расчет размера выборки с использованием консервативного анализа мощности (программа G*Power 3.1.9.4, 2009 г.). Простой размер (27 испытуемых) был основан на двустороннем тесте с эффективным размером 0,05, вероятностью ошибки по алфавиту 0,05, разницей в среднем значении 50%, стандартными отклонениями не более 80% от среднего значения и мощность 0,90.

Принимая во внимание эти параметры, оценивается размер простой выборки от 21 до 30 пациентов на группу.

Образцы щелевой жидкости также будут получены в соответствии с протоколом производителя с использованием бумаги для пародонтоза (Periopaper, Applied Biosystems, Inc, Фостер-Сити, Калифорния). Исследуемые зубы изолируют ватными тампонами и высушивают на воздухе. Бумажные полоски вводятся в десневую борозду примерно на 30 секунд. Образцы пациентов тестовой группы будут взяты из пародонтопатогенных участков и здоровых участков. Образцы, сильно загрязненные слюной или кровью, будут утилизированы.

Образцы будут храниться при температуре -80°C в лаборатории Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Edificio Departamental I, Fundación Clínica Universitaria, URJC (Alcorcon). После того, как все образцы будут получены, будет проведен анализ ELISA всех образцов с использованием специального набора ELISA, имеющегося в продаже для человеческого LL-37 (HyCult Biotechnology, Уден, Нидерланды), и имеющихся в продаже наборов для IL-4, IL-4, IL. -6 и Ил-10 ((Diaclone SAS; Безансон, Франция; 850.890, 950.035 и 850.880 соответственно).

Пациенты тестовой группы получат курс базового лечения пародонта (скейлинг и полировка корней) и инструкции по гигиене полости рта после первого забора образцов.

Повторная оценка через 4-6 недель будет иметь место, когда будут получены новые образцы борозды из обеих групп (испытательная и контрольная), чтобы оценить любую статистически значимую разницу в отношении количества LL-37 по отношению к исходному уровню. замеры записаны. После этого образцы будут снова тщательно изучены путем проведения анализов ELISA в соответствии с протоколом, описанным выше.

После получения всех результатов будет проведен статистический анализ образцов.