De rol van ontstekingsremmende cytokines en antimicrobiële peptide LL-37 biomarkers bij de behandeling van parodontitis.

'De rol van ontstekingsremmende cytokines en antimicrobiële peptide LL-37 biomarkers bij de behandeling van parodontitis.

1. Invoering

   Parodontitis is een infectieus proces dat bestaat uit de vernietiging van de ondersteunende anatomische structuren van de tand, als gevolg van de ontstekingsreactie op de periopathogene activiteit van de subgingivale bacteriële plaque, wat leidt tot een aangeboren, inflammatoire en adaptieve immuunrespons.

   De klinische manifestatie van de ziekte hangt af van gastheer- en omgevingsfactoren, evenals van het specifieke microbiologische agens dat erbij betrokken is. De onderlinge relatie tussen bacteriën en de immuunafweermechanismen van de gastheer vormen de basis van de immunopathologische mechanismen die tot de ziekte leiden. Onder gezonde omstandigheden is er een evenwicht tussen de activiteit van de parodontale microbiota en de immuunrespons van de gastheer.

   In het aangeboren afweersysteem van de mondholte zijn verschillende antimicrobiële peptiden betrokken, waaronder het menselijke cathelicidine LL-37.

   De activiteit van antimicrobiële peptiden zoals LL-37 in de gingivale sulcus wordt beschouwd als een van de grootste afweermechanismen van het parodontium. Het tandvleesepitheel vormt niet alleen een fysieke barrière om bacteriële invasie te voorkomen. Neutrofielen migreren naar het junctionele epitheel en vormen een barrière tussen de bacteriële plaque en het onderliggende epitheel. Ze produceren ook antimicrobiële peptiden, waaronder de 18 kDa (hCAP18). Zodra de neutrofielen zijn geactiveerd als reactie op de bacteriële agressie, komt LL-37 vrij, met een vergelijkbare activiteit als een breedspectrumantibioticum.

   De totale afwezigheid van dit peptide (LL-37) is in verband gebracht met agressieve parodontitis, met name bij patiënten met een neutrofielentekort, zoals degenen die lijden aan het Morfan Kosmann-syndroom

   De aard van dit onderzoek heeft tot doel de rol van LL-37 bij parodontitis op te helderen door het gebruik van een niet-invasieve techniek, zoals creviculaire vloeistofmonsters, te vergelijken bij patiënten met parodontitis, voor en na het ontvangen van een parodontale basisbehandeling (root schalen en schaven). Naast het bovenstaande zullen ook pro- en anti-inflammatoire cytokines (IL-6, IL-4, IL-10 in het bijzonder) worden geëvalueerd voor en na parodontale behandeling. De verkregen monsters zullen worden geanalyseerd door middel van immunohystochemische analyse (ELISA). De kwantificering van LL-37 voor en na parodontale behandeling geassocieerd met de waargenomen klinische bevindingen kan dienen als diagnostische biomarker van de immunopathologische respons die inherent is aan de parodontitis.

2. Verantwoording onderzoeksvraag. Huidige status

   De afgelopen jaren is er door de wetenschappelijke gemeenschap veel moeite gedaan om de complexe immunopathologische processen die verband houden met parodontitis en de relatie tussen de activiteit van de parodontale microbiota en de afweermechanismen van de gastheer te begrijpen.

   De relevantie van dit onderzoek kan dienen om meer in detail de rol van het antimicrobiële peptide LL-37 bij parodontitis te begrijpen, niet alleen vanwege hun bacteriedodende effect, maar ook in de modulatie van de immunologische respons van de gastheer en zijn activiteit voor en na parodontale behandeling. . Het gebrek aan studies over dit onderwerp weerspiegelt de behoefte aan verder onderzoek over dit onderwerp.

   Uiteindelijk kunnen de bevindingen van dit onderzoek de basis vormen van een nieuwe therapeutische benadering gebaseerd op het gebruik van LL-37 om de immunologische respons van de gastheer te helpen moduleren in combinatie met conventionele parodontale behandeling. Dit kan met name relevant zijn bij patiënten die vatbaar zijn voor het ontwikkelen van parodontale of peri-implantaire ziekten of in bepaalde gevallen die resistent zijn tegen conventionele behandelingsalternatieven.

3. Samenvatting van voorgenomen onderzoek

Het hoofddoel van de studie is het onderzoeken van de rol van LL-37 in de immunopathologische respons van het parodontium. De daaropvolgende doelstellingen zijn het onderzoeken van de mogelijkheid om dit microbiële peptide te gebruiken als diagnostisch, prognostisch en therapeutisch middel bij de behandeling van parodontitis.

Onderzoekshypothese: Er zijn significante kwantitatieve verschillen in de niveaus van LL-37 voor en na parodontale behandeling, met een significante vermindering van LL-37 bij herevaluatie (4-6 weken na een parodontale basisbehandeling - wortelschilfering en schaven ).

Nulhypothese: er zijn geen significante kwantitatieve verschillen in de niveaus van LL-37 voor en na parodontale behandeling

De doelstellingen van de huidige studie zijn:

1. Bepaal of gezonde patiënten en patiënten met parodontitis verschillende niveaus van LL-37, IL-6, IL-4 en IL-10 in creviculaire vloeistof hebben bij baseline en relateer deze aan het stadium/de ernst van parodontitis.
2. Evalueer of na een parodontale basisbehandeling deze niveaus van LL-37, IL-6, IL-4 en IL-10 bij baseline vergelijkbaar zijn met de gekwantificeerde niveaus bij gezonde patiënten bij baseline.
3. Evalueer met betrekking tot creviculaire vloeistofmonsters of de niveaus van LL-37, IL-6, IL-4 en IL-10 in door parodontitis aangetaste tanden verschillen van die op gezonde plaatsen bij dezelfde persoon of dat er geen significante verschillen zijn in het bovenstaande voor en na een parodontale behandeling.
4. Stel een niet-invasief protocol op om de immunologische toestand van de patiënt voor en na parodontale behandeling als prognostische factor te evalueren.

4. Materiaal en methoden

Ethische goedkeuring van de Ethische Commissie van de Universiteit Rey Juan Carlos van Madrid (URJC) is verleend. Een selectie van patiënten van de "Master in geavanceerde implantologie, weefselregeneratie en implantaatondersteunde prothese" van de FCU-URJC die voldoen aan de inclusiecriteria en die toestemming geven om deel uit te maken van de studie, zal worden gemaakt.

De toelatingscriteria waren als volgt: 18 jaar of ouder, zonder voorgeschiedenis van parodontale behandeling in de afgelopen zes maanden, en geen medische of tandheelkundige voorgeschiedenis die een contra-indicatie zou kunnen vormen voor parodontale behandeling. Exclusiecriteria waren huidige zwangerschap of borstvoeding, immunologische stoornissen, parodontale behandeling in de afgelopen 6 maanden, orale anticonceptie en antibioticagebruik in de afgelopen 3 maanden, infecties (zoals HIV, hepatitis en tuberculose). Bovendien werden derde molaren uitgesloten van GCF-bemonstering omdat ze vaak werden geïmpacteerd of geëxtraheerd

Rokende patiënten worden niet uitgesloten en worden geclassificeerd als lichte rokers (minder dan 10 sigaretten/dag) of zware rokers (meer dan 10 sigaretten/dag).

Ook diabetespatiënten worden niet uitgesloten, maar wel geïdentificeerd en verantwoord.

Alle patiënten die in de studie zijn opgenomen, doorlopen de volgende fasen:

1. Volledig parodontaal onderzoek (sondediepte (PD), klinisch hechtingsniveau (CAL), plaque-index (PI), bloed bij sonderen (BOP)).

2. De patiënten worden in twee groepen verdeeld:

   • 30 gezonde patiënten (controle)
   • 30 parodontitis patiënten (testparodontitis stadium I-II (15 patiënten), parodontitis stadium III-IV (15 patiënten).

Bij gebrek aan in-vivo-onderzoeken werd een eenvoudige berekening van de steekproefomvang gemaakt met behulp van een conservatieve poweranalyse (G*Power 3.1.9.4-programma, 2009). De eenvoudige maat (27 proefpersonen) was gebaseerd op een tweezijdige toets met een effectieve grootte van 0,05, een alfabetische foutkans van 0,05, een verschil van 50% in gemiddelde waarde, standaardafwijkingen van maximaal 80% van de gemiddelde waarden en een vermogen van 0,90.

Rekening houdend met deze parameters, wordt een eenvoudige steekproefomvang van 21-30 patiënten per groep geschat.

Creviculaire vloeistofmonsters zullen ook worden verkregen volgens het protocol van de fabrikant met behulp van periopapieren (Periopaper, Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). De te onderzoeken tanden worden geïsoleerd met wattenrollen en aan de lucht gedroogd. Papierstrips worden gedurende ongeveer 30 seconden in de gingivale sulcus ingebracht. Monsters van testgroeppatiënten zullen worden genomen van parodontaal pathogene plaatsen en gezonde plaatsen. Sterk besmette monsters met speeksel of bloed worden weggegooid.

Monsters worden bewaard bij -80 C in het laboratorium van Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Edificio Departamental I, Fundación Clínica Universitaria, URJC (Alcorcon). Zodra alle monsters zijn verkregen, wordt ELISA-analyse van alle monsters uitgevoerd met behulp van een specifieke ELISA-kit die in de handel verkrijgbaar is voor humane LL-37 (HyCult Biotechnology, Uden, Nederland) en in de handel verkrijgbare kits voor IL-4, IL-4, IL -6 en IL-10 ((Diaclone SAS; Besançon, Frankrijk; respectievelijk 850.890, 950.035 en 850.880).

Patiënten van de testgroep krijgen na de eerste monsterafname een basisparodontale behandeling (wortelschilfering en schaven) en instructies voor mondhygiëne.

Na 4-6 weken vindt er een herbeoordelingsafspraak plaats waar nieuwe creviculaire vloeistofmonsters van beide groepen worden verkregen (test en controle), om elk statistisch significant verschil met betrekking tot de hoeveelheid LL-37 ten opzichte van de basislijn te evalueren metingen geregistreerd. Daarna worden de monsters opnieuw onderzocht door ELISA-assays uit te voeren volgens het hierboven beschreven protocol.

Zodra alle resultaten zijn verkregen, wordt een statistische analyse van de monsters uitgevoerd.