Objasnění mikrobiomu u pacientek s opakovanou ztrátou těhotenství

Cíle Cílem této studie je zhodnotit vaginální a intrauterinní mikrobiotu u žen s rekurentní ztrátou těhotenství (RPL) ve srovnání s normálními kontrolami. Nakonec bychom chtěli posoudit, zda ženy s RPL mají charakteristický mikrobiom, který může být významně odlišnou mikroflórou zdravých pacientů v naší studované populaci. To by mohlo později vést k léčbě přizpůsobeným přístupem transplantace mikrobioty zahrnující zdravou vaginální mikrobiotu pro léčbu pacientek s RPL a její implementaci v prospektivní randomizované kontrolované studii s cílem modulovat mikrobiotu reprodukčního traktu a dosáhnout a zlepšit výsledek těhotenství.

Pozadí

Rychle rostoucí oblastí biologického výzkumu lidského zdraví a nemocí je výzkum mikrobiomů. Již dlouho se předpokládá, že mikrobiom obývající ženský reprodukční trakt hraje důležitou roli ve zdraví a nemoci. Současné teorie naznačují, že změněná mikrobiota i bez klinické infekce může vyvolat zánětlivou reakci v endometriu. Ovlivňuje úspěšnost implantace embrya a budoucí vývoj těhotenství.5 Většina studií se zabývá mikrobiomem genitálního traktu u pacientek s opakovaným selháním implantace při IVF, některé studie však také zjistily změněný mikrobiom u pacientek s opakovanou ztrátou těhotenství (RPL)6 Vaginální a endometriální mikrobioty mohou být nezávislé. Endometriální mikroflóra má bohatší alfa diverzitu než vaginální mikroflóra a dysbióza vaginální nebo endometriální mikroflóry může způsobit selhání implantace. Na rozdíl od předchozích zpráv Ichiyama et al uvádějí, že výskyt Lactobacillus ve vagíně, ale ne v endometriu, může být biomarkerem opakovaného selhání implantace7 Malé studie ukázaly souvislost mezi spontánním potratem a abnormálním vaginálním mikrobiomem (60 % střední flóry, 20 % BV stav ), s vyššími hladinami vybraných metabolitů ve vaginálním prostředí (např. inosin, fumarát, xanthin, benzoát, askorbát)8 Opakovaná těhotenská ztráta (RPL) je definována Americkou společností pro reprodukční medicínu jako dva nebo více spontánních potratů před 22. týdnem těhotenství ( nemusí nutně následovat) Úloha vaginálních infekcí u RPL je kontroverzní a screening infekcí se u pacientek s RPL9 běžně nedoporučuje

Hlavní imunitní buňky v lidském endometriu zahrnují děložní přirozené zabíječe (uNK) buňky, makrofágy, dendritické buňky (DC) a T buňky. Každá z těchto buněčných populací demonstrovala specifickou roli. uNK se podílejí na úspěchu implantace a udržení těhotenství díky své schopnosti interagovat prostřednictvím inhibičních receptorů s HLA-G, HLA-E a HLA-C exprimovanými na trofoblastových buňkách a produkovat angiogenní faktory Kuon et al ve své malé studii popsané že pacienti s RPL se zvýšenou pNK trpí častěji kolonizací Gardnerella vaginalis a gramnegativními anaeroby. To může naznačovat souvislost mezi vaginální mikrobiotou, lokálním zánětem, změnami imunitních parametrů a potratem.10 Stejně jako vaginální mikrobiom, endometriální mikrobiom obvykle dominují laktobacily. 11 Nedávné studie ukázaly, že přítomnost mikrobiomu nedominujícího Lactobacillus v endometriální tekutině pacientek s IVF byla spojena s významně nižší implantací, těhotenstvím a porodností 12 13 Podle výzkumů složení mikrobioty v endometriální tekutině plně neodráží to v tkáň endometria.14 Avšak pouze několik studií přímo zkoumalo mikroby v děložním prostředí a to, jak mohou tyto mikroby ovlivnit implantaci, většina z nich v cyklech IVF.

Potrat v prvním trimestru může být spojen se sníženou prevalencí Lactobacillus spp. a se změnami v relativním množství několika bakteriálních rodů, včetně Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 a Lac_Roseburia 15 16

Chen W et al prokázali relativní abundance Actinobacteria a Fusobacteria v tzv. skupině chronické endometritidy na úrovni kmene. Na úrovni rodu byly pozorovány vysoké relativní abundance Gardnerella ve skupinách s chronickou endometriózou a netěhotných, což významně negativní výsledek IVF17

Nastavení a účastníci Všem pacientům odeslaným do univerzitní nemocnice Assuta Ashdod kvůli RPL, kteří splňují kritéria pro zařazení, bude nabídnut nábor.

Kritéria pro zařazení zahrnují:

• ženy ve věku 18-40 let se dvěma nebo více po sobě jdoucími potraty.

Kritéria vyloučení budou zahrnovat:

• zdokumentované minulé PID,
• předchozí anamnéza malformací dělohy,
• pacientky s hyperplazií a rakovinou endometria,
• pacientů s IUD a antimikrobiální léčbou v předchozích 4 týdnech.

Metodika a techniky studia

Studovat design

Po získání informovaného souhlasu odebereme vzorky ze 4 anatomických lokalit: dolní třetina pochvy (před umístěním zrcátka), zadní fornix a cervikální kanál (po sterilním umístění zrcátka) a vzorek střevního mikrobiomu.

Velikost vzorku – 20 žen pro každou patologii ve výzkumné skupině a 20 žen v kontrolní skupině, to je podobné jako u jiných studií na toto téma 4.

Ze zdravotní dokumentace budou shromažďovány následující údaje:

• stáří,
• etnikum,
• BMI,
• Životní styl: kouření tabáku, počet partnerů za posledních 6 měsíců, strava, hygienické postupy,
• Gynekologická a porodnická anamnéza: gravidita, parita, doba menarché, pravidelnost menstruačního cyklu,
• Druh a délka antikoncepce,
• Příznaky: bolest, menometroragie,
• sonografický nález,

Vzorky z pochvy, fornixu a cervikálního kanálu budou odebrány zavedením semišovaného nylonového tamponu do vagíny pomocí zrcátka a kruhovým stěrem po dobu 5-10 sekund před použitím jakýchkoli antiseptik. Celkem tedy bude odebráno 160 vzorků (3 skupiny pacientů (n=20*2) * 4 vzorky).

Vzorky se rychle zmrazí na -80 °C a uchovávají se až do další analýzy. Vzorky stěrů v dávce budou podrobeny extrakci mikrobiální DNA pomocí standardních protokolů Human Microbiome Project (HMP). Po extrakci bude provedena PCR reakce pro amplifikaci genu 16S RNA pomocí sad HMP primerů. 16S amplikony budou sekvenovány pomocí sekvenačních platforem nové generace Illumina (PE 250bpX2).

Sekvenační data budou analyzována v laboratoři Moran-Gilad, Ben-Gurion University. Bioinformatická analýza bude založena na softwarovém balíku QIIME pipeline18. Stručně řečeno, mikrobiomová data budou analyzována pomocí standardních metod pro vzácnost, alfa a beta diverzitu a početnost taxonů na různých taxonomických úrovních. Test ANOVA se použije k určení, zda se relativní četnost OTU mezi vzorky liší, G test nezávislosti se použije k určení asociace přítomnosti/nepřítomnosti OTU se specifickou kategorií a významné rozdíly mezi skupinami vzorků budou analyzovány pomocí DESeq2 R balíček 19na surové nenormalizované tabulce biomů OTU.

Strategie náboru

Pacienti budou vybíráni z ambulantní kliniky ve Fakultní nemocnici Samson Assuta v souladu s protokolem, který je ve schvalovacím procesu místní Institutional Review Board (IRB).

Zkoušející informuje pacienta o studii, jejím účelu a způsobu randomizace studijních skupin. Pacienti nebudou přemlouváni k účasti na této studii. Zkoušející prodiskutuje předvídatelná související rizika a potenciální přínosy pro každou studijní skupinu. Pacientům, kteří souhlasili s tím, aby jejich informace byly získány během studie za účelem analýzy výsledků, bude po celou dobu zachována jejich důvěrnost pomocí kódu studie jako identifikátoru ve výzkumné databázi. Pacienti budou informováni zkoušejícím, že jejich lékařská léčba nebude žádným způsobem ovlivněna jejich rozhodnutím, zda se studie zúčastnit či nikoli. Pacienti budou informováni, že se mohou rozhodnout odstoupit ze studie v kterékoli fázi, aniž by ohrozili jakoukoli další lékařskou péči. Před zařazením do této studie musí zkoušející od pacienta získat podepsaný a datovaný informovaný souhlas. Originál podepsaný a datovaný informační list a souhlas pacienta si ponechá zkoušející. Pacientovi bude poskytnuta podepsaná kopie.

Statistická analýza

Statistická analýza bude provedena pomocí softwarového prostředí R pro statistické výpočty a grafiku. Data kategoriálních proměnných budou prezentována pomocí percentilu a statistická významnost bude testována pomocí X² nebo Fisherova exaktního testu, podle potřeby. Data ordinálních proměnných budou prezentována pomocí mediánu a interkvartilového rozmezí a statistická významnost bude analyzována pomocí Mann Whitney testu. Data spojitých proměnných budou prezentována pomocí průměru a směrodatné odchylky, pro statistickou analýzu bude použit Studentův t test

Etika

Tento protokol studie bude předložen ke schválení Etické komisi univerzitní nemocnice Assuta Ashdod. Studie bude provedena v souladu s etickými principy vycházejícími z Helsinské deklarace a GCP (ICH E6) a v souladu s místními regulačními požadavky. Totožnost účastníků bude důvěrná a v rozsahu povoleném příslušnými zákony a/nebo předpisy nebude veřejně dostupná. Pokud budou výsledky studie zveřejněny, totožnost účastníků zůstane důvěrná.

Informovaný souhlas bude získán v souladu se směrnicemi ICH/GCP a Helsinskou deklarací a bude zaveden před provedením postupů specifických pro protokol. Rizika a přínosy účasti ve studii budou každému potenciálnímu účastníkovi slovně vysvětleny před podpisem formuláře souhlasu v souladu s místními regulačními právními požadavky. Podepsaný formulář souhlasu si zkoušející ponechá a kopii poskytne každému účastníkovi.

Zdrojová dokumentace

Zkoušející bude uchovávat přesné oddělené záznamy o všech shromážděných studijních datech účastníků, včetně všech souvisejících informací souvisejících se studií. Vyšetřovatelé se zavázali k důkladné dokumentaci všech vedlejších účinků a nežádoucích příhod během studie v pořadači účastnické studie, včetně jakýchkoli diagnostických testů prováděných během studie.

Veškerá dokumentace studie bude uchovávána po dobu 15 let poté, co všichni účastníci absolvují a shromáždí všechna data. IRB/IEC bude písemně informována o dokončení studie a archivu.