Aufklärung des Mikrobioms bei Patientinnen mit wiederkehrendem Schwangerschaftsverlust

Ziele Das Ziel der aktuellen Studie ist es, die vaginale und intrauterine Mikrobiota bei Frauen mit rezidivierendem Schwangerschaftsverlust (RPL) im Vergleich zu normalen Kontrollen zu bewerten. Letztendlich möchten wir beurteilen, ob Frauen mit RPL ein charakteristisches Mikrobiom haben, das sich möglicherweise signifikant von dem Mikrobiom gesunder Patienten in unserer Studienpopulation unterscheidet. Dies könnte später zu einer Behandlung mit einem maßgeschneiderten Mikrobiota-Transplantationsansatz führen, der gesunde vaginale Mikrobiota zur Behandlung von Patienten mit RPL einbezieht und in einer prospektiven randomisierten kontrollierten Studie implementiert, um die Mikrobiota des Fortpflanzungstrakts zu modulieren und ein verbessertes Schwangerschaftsergebnis zu erzielen.

Hintergrund

Ein schnell wachsendes Feld in der biologischen Erforschung der menschlichen Gesundheit und Krankheit ist die Mikrobiomforschung. Das Mikrobiom im weiblichen Fortpflanzungstrakt steht seit langem im Verdacht, eine wichtige Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu spielen. Aktuelle Theorien deuten darauf hin, dass eine veränderte Mikrobiota auch ohne klinische Infektion eine Entzündungsreaktion im Endometrium auslösen kann. Es beeinflusst den Erfolg der Embryonenimplantation und die zukünftige Entwicklung der Schwangerschaft.5 Die meisten Studien befassen sich mit dem Mikrobiom des Genitaltrakts bei Patienten mit wiederholtem Einnistungsversagen bei IVF, einige Studien haben jedoch auch ein verändertes Mikrobiom bei Patienten mit wiederholtem Schwangerschaftsverlust (RPL)6 gefunden. Vaginale und endometriale Mikrobiota können unabhängig voneinander sein. Die Endometrium-Mikrobiota hat eine größere Alpha-Diversität als die Vaginal-Mikrobiota, und eine Dysbiose der Vaginal- oder Endometrium-Mikrobiota kann zu einem Implantationsversagen führen. Im Gegensatz zu früheren Berichten berichten Ichiyama et al., dass die Lactobacillus-Rate in der Vagina, aber nicht im Endometrium, ein Biomarker für wiederholtes Einnistungsversagen sein könnte ), mit höheren Konzentrationen ausgewählter Metaboliten in der Vaginalumgebung (z. B. Inosin, Fumarat, Xanthin, Benzoat, Ascorbat)8 Rezidivierender Schwangerschaftsverlust (RPL) wird von der American Society for Reproductive Medicine als zwei oder mehr spontane Fehlgeburten vor der 22. nicht notwendigerweise konsekutiv) Die Rolle vaginaler Infektionen bei RPL ist umstritten und ein Screening auf Infektionen wird bei Patientinnen mit RPL9 nicht routinemäßig empfohlen

Zu den wichtigsten Immunzellen im menschlichen Endometrium gehören uterine Natural Killer (uNK)-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen (DCs) und T-Zellen. Jede dieser Zellpopulationen demonstrierte eine spezifische Rolle. uNK sind am Erfolg der Implantation und Aufrechterhaltung der Schwangerschaft durch ihre Fähigkeit beteiligt, sowohl über Inhibitorrezeptoren mit HLA-G, HLA-E und HLA-C zu interagieren, die auf Trophoblastzellen exprimiert werden, als auch angiogene Faktoren zu produzieren, die Kuon et al. in ihrer kleinen Studie beschrieben dass RPL-Patienten mit erhöhtem pNK häufiger unter einer Besiedelung durch Gardnerella vaginalis und gramnegative Anaerobier leiden. Dies könnte auf einen Zusammenhang zwischen der vaginalen Mikrobiota, lokalen Entzündungen, Veränderungen der Immunparameter und Fehlgeburten hindeuten.10 Wie das vaginale Mikrobiom wird auch das endometriale Mikrobiom normalerweise von Laktobazillen dominiert. 11 Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass das Vorhandensein eines nicht Lactobacillus-dominierenden Mikrobioms in der Gebärmutterschleimhaut von IVF-Patientinnen mit signifikant niedrigeren Einnistungs-, Schwangerschafts- und Lebendgeburtenraten verbunden war Endometriumgewebe.14 Allerdings haben nur wenige Studien die Mikroben in der Gebärmutterumgebung direkt untersucht und wie diese Mikroben die Implantation beeinflussen könnten, die meisten von ihnen in IVF-Zyklen.

Eine Fehlgeburt im ersten Trimenon kann mit einer verringerten Prävalenz von Lactobacillus spp. in Verbindung gebracht werden. und mit Änderungen in der relativen Häufigkeit mehrerer Bakteriengattungen, einschließlich Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 und Lac_Roseburia 15 16

Chen W et al. zeigten die relativen Häufigkeiten von Actinobacteria und Fusobacteria in der Gruppe der sogenannten chronischen Endometritis auf Stammebene das negative IVF-Ergebnis17

Einstellungen und Teilnehmer Allen Patienten, die aufgrund von RPL an das Universitätskrankenhaus Assuta Ashdod überwiesen werden und die Einschlusskriterien erfüllen, wird eine Rekrutierung angeboten.

Zu den Aufnahmekriterien gehören:

• Frauen im Alter von 18 bis 40 Jahren mit zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Fehlgeburten.

Zu den Ausschlusskriterien gehören:

• dokumentierte vergangene PID,
• Vorgeschichte von Gebärmutterfehlbildungen,
• Patientinnen mit Hyperplasie und Endometriumkarzinom,
• Patienten mit Spirale und antimikrobieller Behandlung in den vorangegangenen 4 Wochen.

Studieren Sie Methoden und Techniken

Studiendesign

Nach Erhalt der Einverständniserklärung werden wir Proben von 4 anatomischen Stellen entnehmen: unteres Drittel der Vagina (vor der Platzierung des Spekulums), hinterer Fornix und Zervikalkanal (nach der Platzierung des sterilen Spekulums) und eine Probe des Darmmikrobioms.

Stichprobengröße – 20 Frauen für jede Pathologie in der Forschungsgruppe und 20 Frauen in der Kontrollgruppe, dies ist ähnlich wie bei anderen Studien zu diesem Thema 4.

Folgende Daten werden aus Krankenakten erhoben:

• Alter,
• Ethnizität,
• BMI,
• Lebensstil: Tabakkonsum, Anzahl der Partner in den letzten 6 Monaten, Ernährung, hygienische Verfahren,
• Gynäkologische und geburtshilfliche Anamnese: Gravidität, Parität, Menarchezeit, Regelmäßigkeit des Menstruationszyklus,
• Art und Dauer der Empfängnisverhütung,
• Symptome: Schmerzen, Menometrorrhagie,
• Sonographische Befunde,

Proben aus der Vagina, dem Fornix und dem Zervikalkanal werden entnommen, indem ein beflockter Nylontupfer über ein Spekulum in die Vagina eingeführt und 5-10 Sekunden lang kreisförmig abgetupft wird, bevor Antiseptika verwendet werden. Somit werden insgesamt 160 Proben (3 Patientengruppen (n=20*2) * 4 Proben) entnommen.

Die Proben werden bei -80 °C schockgefroren und bis zur weiteren Analyse aufbewahrt. Batch-Abstrichproben werden einer mikrobiellen DNA-Extraktion unter Verwendung von Standardprotokollen des Human Microbiome Project (HMP) unterzogen. Nach der Extraktion wird eine PCR-Reaktion zur Amplifikation des 16S-RNA-Gens unter Verwendung von HMP-Primersets durchgeführt. 16S-Amplikons werden unter Verwendung einer Sequenzierungsplattform der nächsten Generation von Illumina (PE 250bpX2) sequenziert.

Die Sequenzdaten werden im Moran-Gilad-Labor der Ben-Gurion-Universität analysiert. Die bioinformatische Analyse basiert auf der QIIME-Softwarepaket-Pipeline18. Kurz gesagt, Mikrobiomdaten werden mit Standardmethoden für Verdünnung, Alpha- und Beta-Diversität und Häufigkeit von Taxa auf verschiedenen taxonomischen Ebenen analysiert. Der ANOVA-Test wird verwendet, um zu bestimmen, ob die relative OTU-Häufigkeit zwischen den Proben unterschiedlich ist, der G-Unabhängigkeitstest wird verwendet, um die Assoziation von OTU-Anwesenheit/-Abwesenheit mit einer bestimmten Kategorie zu bestimmen, und signifikante Unterschiede zwischen Probengruppen werden mit DESeq2 R analysiert Paket 19 in der rohen, nicht normalisierten OTU-Biom-Tabelle.

Rekrutierungsstrategie

Die Patienten werden aus der Ambulanz des Samson Assuta University Hospital gemäß einem Protokoll rekrutiert, das sich im Genehmigungsverfahren des örtlichen Institutional Review Board (IRB) befindet.

Der Prüfarzt informiert den Patienten über die Studie, ihren Zweck und die Methode der Randomisierung der Studiengruppen. Patienten werden nicht zur Teilnahme an dieser Studie überredet. Der Prüfarzt wird die damit verbundenen vorhersehbaren Risiken sowie den potenziellen Nutzen für jede Studiengruppe erörtern. Patienten, die zugestimmt haben, dass ihre Informationen während der Studie zur Analyse der Ergebnisse erhoben werden, werden jederzeit vertraulich behandelt, indem sie einen Studiencode als Kennung in der Forschungsdatenbank verwenden. Die Patienten werden vom Prüfarzt darüber informiert, dass ihre medizinische Behandlung in keiner Weise durch ihre Entscheidung, an der Studie teilzunehmen oder nicht, beeinflusst wird. Die Patienten werden darüber informiert, dass sie jederzeit aus der Studie ausscheiden können, ohne die weitere medizinische Versorgung zu gefährden. Vor der Aufnahme in diese Studie muss der Prüfarzt vom Patienten eine unterschriebene und datierte Einverständniserklärung einholen. Das unterschriebene und datierte Originalinformationsblatt und die Patienteneinwilligung werden vom Prüfarzt aufbewahrt. Dem Patienten wird eine unterschriebene Kopie ausgehändigt.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wird unter Verwendung der R-Softwareumgebung für statistische Berechnungen und Grafiken durchgeführt. Kategoriale Variablendaten werden unter Verwendung von Perzentilen dargestellt, und die statistische Signifikanz wird je nach Bedarf mit dem X²- oder Fisher-Exakt-Test getestet. Ordinale Variablendaten werden unter Verwendung des Median- und Interquartilbereichs dargestellt und die statistische Signifikanz wird unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests analysiert. Kontinuierliche Variablendaten werden unter Verwendung von Mittelwert und Standardabweichung dargestellt, der Student-t-Test wird für die statistische Analyse verwendet

Ethik

Dieses Studienprotokoll wird der Ethikkommission des Assuta Ashdod University Hospital zur Genehmigung vorgelegt. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen durchgeführt, die aus der Deklaration von Helsinki und GCP (ICH E6) hervorgehen, und in Übereinstimmung mit den lokalen behördlichen Anforderungen. Die Identität der Teilnehmer wird vertraulich behandelt und im Rahmen der geltenden Gesetze und/oder Vorschriften nicht öffentlich zugänglich gemacht. Wenn die Studienergebnisse veröffentlicht werden, bleibt die Identität der Teilnehmer vertraulich.

Die Einwilligung nach Aufklärung wird gemäß den ICH/GCP-Richtlinien und der Deklaration von Helsinki eingeholt und umgesetzt, bevor protokollspezifische Verfahren durchgeführt werden. Die Risiken und Vorteile der Teilnahme an der Studie werden jedem potenziellen Teilnehmer mündlich erklärt, bevor er die Einwilligungserklärung gemäß den lokalen gesetzlichen Bestimmungen unterzeichnet. Das unterschriebene Einwilligungsformular wird vom Prüfer aufbewahrt und jedem Teilnehmer wird eine Kopie zur Verfügung gestellt.

Quelldokumentation

Der Prüfarzt führt genaue getrennte Aufzeichnungen der gesammelten Studiendaten aller Teilnehmer, einschließlich aller relevanten studienbezogenen Informationen. Die Prüfärzte verpflichten sich zur gründlichen Dokumentation aller Nebenwirkungen und unerwünschten Ereignisse während der Studie in einem Studienteilnehmerordner, einschließlich aller während der Studie durchgeführten diagnostischen Tests.

Alle Studienunterlagen werden 15 Jahre lang aufbewahrt, nachdem alle Teilnehmer abgeschlossen und alle Daten gesammelt wurden. Der Abschluss der Studie und der Archivstandort werden dem IRB/IEC schriftlich mitgeteilt.