Wyjaśnienie mikrobiomu u pacjentek z nawracającą utratą ciąży

Cele Celem pracy jest ocena mikroflory pochwy i wewnątrzmacicznej kobiet z nawracającą utratą ciąży (RPL) w porównaniu z grupą kontrolną. Docelowo chcielibyśmy ocenić, czy kobiety z RPL mają charakterystyczny mikrobiom, który może istotnie różnić się mikrobiomem zdrowych pacjentek w naszej badanej populacji. Może to później doprowadzić do leczenia za pomocą dostosowanego podejścia do przeszczepiania mikrobiomu obejmującego zdrową mikroflorę pochwy w leczeniu pacjentek z RPL i wdrożenia go w prospektywnym randomizowanym badaniu kontrolowanym w celu modulowania mikroflory układu rozrodczego i osiągnięcia i poprawy wyników ciąży.

Tło

Szybko rozwijającą się dziedziną badań biologicznych nad zdrowiem i chorobami człowieka są badania nad mikrobiomem. Od dawna podejrzewa się, że mikrobiom zamieszkujący żeński układ rozrodczy odgrywa ważną rolę w zdrowiu i chorobie. Obecne teorie sugerują, że zmieniona mikrobiota, nawet bez klinicznej infekcji, może wywołać reakcję zapalną w endometrium. Wpływa na powodzenie implantacji zarodka i przyszły rozwój ciąży.5 Większość badań dotyczy mikrobiomu dróg rodnych u pacjentek z powtarzającymi się niepowodzeniami implantacji w IVF, jednak niektóre badania wykazały również zmieniony mikrobiom u pacjentek z nawracającą utratą ciąży (RPL)6. Mikroflora pochwy i endometrium mogą być niezależne. Mikrobiota endometrium ma bogatszą różnorodność alfa niż mikroflora pochwy, a dysbioza mikroflory pochwy lub endometrium może powodować niepowodzenie implantacji. W przeciwieństwie do poprzednich doniesień, Ichiyama i wsp. donoszą, że odsetek Lactobacillus w pochwie, ale nie w endometrium, może być biomarkerem powtarzających się niepowodzeń implantacji7. Niewielkie badania wykazały związek między spontanicznym poronieniem a nieprawidłowym mikrobiomem pochwy (60% pośredniej flory, 20% BV ), z wyższymi poziomami wybranych metabolitów w środowisku pochwy (np. inozyny, fumaranu, ksantyny, benzoesanu, askorbinianu)8 Nawracająca utrata ciąży (RPL) jest zdefiniowana przez American Society for Reproductive Medicine jako dwa lub więcej samoistnych poronień przed 22. tygodniem ciąży ( niekoniecznie kolejne) Rola infekcji pochwy w RPL jest kontrowersyjna, a badania przesiewowe w kierunku infekcji nie są rutynowo zalecane u pacjentek z RPL9

Główne komórki odpornościowe w ludzkim endometrium obejmują maciczne komórki naturalnych zabójców (uNK), makrofagi, komórki dendrytyczne (DC) i limfocyty T. Każda z tych populacji komórek pełniła określoną rolę. uNK są zaangażowane w powodzenie implantacji i utrzymanie ciąży poprzez ich zdolność zarówno do interakcji poprzez receptory inhibitorowe z HLA-G, HLA-E i HLA-C wyrażanymi na komórkach trofoblastu, jak i do wytwarzania czynników angiogennych Kuon i wsp. w swoim małym badaniu opisanym że pacjenci z RPL z podwyższonym pNK częściej cierpią z powodu kolonizacji przez Gardnerella vaginalis i Gram-ujemne beztlenowce. Może to wskazywać na związek między mikrobiomem pochwy, miejscowym stanem zapalnym, zmianami parametrów immunologicznych i poronieniami.10 Podobnie jak mikrobiom pochwy, mikrobiom endometrium jest zwykle zdominowany przez pałeczki kwasu mlekowego. 11 Niedawne badania wykazały, że obecność mikrobiomu innego niż Lactobacillus w płynie endometrium pacjentek IVF wiązała się ze znacznie niższym wskaźnikiem implantacji, ciąży i żywych urodzeń 12 13 Według badań skład mikrobiomu w płynie endometrialnym nie odzwierciedla w pełni tego, tkanka endometrium.14 Jednak tylko kilka badań dotyczyło bezpośrednio drobnoustrojów w środowisku macicy i wpływu tych drobnoustrojów na implantację, większość z nich dotyczyła cykli IVF.

Poronienie w pierwszym trymestrze ciąży może być związane ze zmniejszoną częstością występowania Lactobacillus spp. oraz ze zmianami względnej liczebności kilku rodzajów bakterii, w tym Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 i Lac_Roseburia 15 16

Chen W i wsp. wykazali względną liczebność Actinobacteria i Fusobacteria w tak zwanej grupie z przewlekłym zapaleniem błony śluzowej macicy na poziomie typu. negatywny wynik IVF17

Warunki i uczestnicy Wszystkim pacjentom skierowanym do szpitala uniwersyteckiego Assuta Ashdod z powodu RPL, spełniającym kryteria włączenia, zostanie zaoferowana rekrutacja.

Kryteria włączenia obejmują:

• kobiety w wieku 18-40 lat, które miały dwa lub więcej kolejnych poronień.

Kryteria wykluczenia będą obejmować:

• udokumentowany poprzedni PID,
• wcześniejsza historia wad rozwojowych macicy,
• pacjentki z hiperplazją i rakiem endometrium,
• pacjentów z wkładką domaciczną i leczeniem przeciwdrobnoustrojowym w ciągu ostatnich 4 tygodni.

Metodologia i techniki badania

Projekt badania

Po uzyskaniu świadomej zgody pobierzemy próbki z 4 lokalizacji anatomicznych: dolnej jednej trzeciej pochwy (przed umieszczeniem wziernika), tylnego sklepienia i kanału szyjki macicy (po sterylnym umieszczeniu wziernika) oraz próbkę mikrobiomu jelitowego.

Liczebność próby – 20 kobiet dla każdej patologii w grupie badawczej i 20 kobiet w grupie kontrolnej, podobnie jak w innych badaniach na ten temat 4.

Z dokumentacji medycznej będą zbierane następujące dane:

• wiek,
• pochodzenie etniczne,
• BMI,
• Styl życia: palenie tytoniu, liczba partnerów w ciągu ostatnich 6 miesięcy, dieta, procedury higieniczne,
• Wywiad ginekologiczno-położniczy: ciąża, poród, czas pierwszej miesiączki, regularność cyklu miesiączkowego,
• Rodzaj i czas trwania antykoncepcji,
• Objawy: ból, krwotok miesiączkowy,
• ustalenia ultrasonograficzne,

Próbki z pochwy, sklepienia i kanału szyjki macicy zostaną pobrane poprzez wprowadzenie do pochwy nylonowego wacika za pomocą wziernika i wymazywania okrężnego przez 5-10 sekund przed użyciem jakichkolwiek środków antyseptycznych. Tak więc łącznie zostanie pobranych 160 próbek (3 grupy pacjentów (n=20*2) * 4 próbki).

Próbki zostaną szybko zamrożone w temperaturze -80°C i przechowywane do dalszej analizy. Pobrane próbki wymazów zostaną poddane ekstrakcji DNA drobnoustrojów przy użyciu standardowych protokołów Human Microbiome Project (HMP). Po ekstrakcji zostanie przeprowadzona reakcja PCR w celu amplifikacji genu 16S RNA przy użyciu zestawów starterów HMP. Amplikony 16S będą sekwencjonowane przy użyciu platform sekwencjonowania nowej generacji Illumina (PE 250bpX2).

Dane sekwencjonowania zostaną przeanalizowane w laboratorium Moran-Gilad na Uniwersytecie Ben-Guriona. Analiza bioinformatyczna będzie oparta na rurociągu pakietu oprogramowania QIIME18. Krótko mówiąc, dane dotyczące mikrobiomu zostaną przeanalizowane przy użyciu standardowych metod rozrzedzenia, różnorodności alfa i beta oraz obfitości taksonomii na różnych poziomach taksonomicznych. Test ANOVA zostanie wykorzystany do określenia, czy względna obfitość OTU jest różna między próbkami, test niezależności G zostanie wykorzystany do określenia powiązania obecności/nieobecności OTU z określoną kategorią, a znaczące zróżnicowanie między grupami próbek zostanie przeanalizowane przy użyciu DESeq2 R pakiet 19 na surowej nieznormalizowanej tabeli biom OTU.

Strategia rekrutacji

Pacjenci będą rekrutowani z przychodni w szpitalu uniwersyteckim Samson Assuta zgodnie z protokołem, który jest w trakcie zatwierdzania przez lokalną Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB).

Badacz poinformuje pacjenta o badaniu, jego celu i sposobie losowania grup badawczych. Pacjenci nie będą nakłaniani do udziału w tym badaniu. Badacz omówi możliwe do przewidzenia ryzyko, jak również potencjalne korzyści dla każdej badanej grupy. Pacjenci, którzy wyrazili zgodę na pozyskanie ich danych w trakcie badania w celu analizy wyników, będą każdorazowo zachowywani w poufności za pomocą kodu badania jako identyfikatora w bazie danych badań. Pacjenci zostaną poinformowani przez Badacza, że ​​ich decyzja o uczestnictwie w badaniu nie będzie miała żadnego wpływu na ich leczenie. Pacjenci zostaną poinformowani, że mogą wycofać się z badania na dowolnym etapie bez narażania dalszej opieki medycznej. Przed włączeniem do tego badania badacz musi uzyskać podpisaną i opatrzoną datą Świadomą zgodę od pacjenta. Oryginalna podpisana i opatrzona datą karta informacyjna oraz zgoda pacjenta będą przechowywane przez Badacza. Podpisany egzemplarz zostanie przekazany pacjentowi.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu środowiska oprogramowania R do obliczeń statystycznych i grafiki. Dane dotyczące zmiennych jakościowych zostaną przedstawione przy użyciu percentyla, a istotność statystyczna zostanie przetestowana przy użyciu odpowiednio X² lub dokładnego testu Fishera. Dane dotyczące zmiennych porządkowych zostaną przedstawione za pomocą mediany i rozstępu międzykwartylowego, a istotność statystyczna zostanie przeanalizowana za pomocą testu Manna Whitneya. Ciągłe dane zmienne zostaną przedstawione za pomocą średniej i odchylenia standardowego, do analizy statystycznej wykorzystany zostanie test t-Studenta

Etyka

Ten protokół badania zostanie przedłożony do zatwierdzenia komisji ds. etyki szpitala uniwersyteckiego Assuta Ashdod. Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi wynikającymi z Deklaracji Helsińskiej i GCP (ICH E6) oraz zgodnie z lokalnymi wymogami regulacyjnymi. Tożsamość uczestników będzie traktowana jako poufna iw zakresie dozwolonym przez obowiązujące przepisy prawa i/lub regulacje nie będzie udostępniana publicznie. Jeśli wyniki badania zostaną opublikowane, tożsamość uczestników pozostanie poufna.

Świadoma zgoda zostanie uzyskana zgodnie z wytycznymi ICH/GCP oraz Deklaracją Helsińską i zostanie wdrożona przed przeprowadzeniem procedur określonych w protokole. Ryzyka i korzyści wynikające z udziału w badaniu zostaną ustnie wyjaśnione każdemu potencjalnemu uczestnikowi przed podpisaniem formularza zgody zgodnie z lokalnymi wymogami prawnymi. Podpisany formularz zgody zostanie zachowany przez badacza, a kopia zostanie przekazana każdemu uczestnikowi.

Dokumentacja źródłowa

Badacz będzie prowadził dokładne oddzielne zapisy zebranych danych z badań wszystkich uczestników, w tym wszystkie istotne informacje związane z badaniem. Badacze są zobowiązani do dokładnego udokumentowania wszystkich skutków ubocznych i zdarzeń niepożądanych podczas badania w segregatorze badania uczestnika, w tym wszelkich testów diagnostycznych przeprowadzonych podczas badania.

Cała dokumentacja badania będzie przechowywana przez 15 lat po ukończeniu przez wszystkich uczestników i zebraniu wszystkich danych. IRB/IEC zostanie powiadomiony na piśmie o zakończeniu badania i miejscu archiwizacji.