Belysning af mikrobiomet hos patienter med tilbagevendende graviditetstab

Mål Formålet med denne undersøgelse er at evaluere vaginal og intrauterin mikrobiota hos kvinder med recidiverende graviditetstab (RPL) sammenlignet med normale kontroller. I sidste ende vil vi gerne vurdere, om kvinder med RPL har et karakteristisk mikrobiom, som kan være signifikant forskellig mikrobiota af raske patienter i vores undersøgelsespopulation. Dette kunne senere føre til behandling med en skræddersyet mikrobiotatransplantationstilgang, der involverer sund vaginal mikrobiota til behandling af patienter med RPL og implementere den i et prospektivt randomiseret kontrolleret forsøg med henblik på at modulere den reproduktive mikrobiota og opnå og forbedret graviditetsresultat.

Baggrund

Et hurtigt voksende område inden for biologisk forskning af menneskers sundhed og sygdom er forskningen i mikrobiom. Mikrobiomet, der bebor det kvindelige forplantningsorgan, har længe været mistænkt for at spille en vigtig rolle i sundhed og sygdom. Aktuelle teorier tyder på, at ændret mikrobiota selv uden klinisk infektion kan udløse en inflammatorisk reaktion i endometriet. Det påvirker succesen med embryoimplantation og fremtidig udvikling af graviditeten.5 De fleste undersøgelser omhandler mikrobiom i kønsorganerne hos patienter med gentagen implantationsfejl i IVF, men nogle undersøgelser har også fundet ændret mikrobiom hos patienter med recidiverende graviditetstab (RPL)6 Vaginale og endometriemikrobiotaser kan være uafhængige. Endometrial mikrobiota har en rigere alfa-diversitet end vaginal mikrobiota, og dysbiose af vaginal eller endometriemikrobiota kan forårsage implantationsfejl. I modsætning til tidligere rapporter rapporterer Ichiyama et al, at Lactobacillus-frekvensen i skeden, men ikke endometriet, kan være en biomarkør for gentagen implantationsfejl7 Små undersøgelser viste sammenhæng mellem spontan abort og unormalt vaginalt mikrobiom (60 % mellemflora, 20 % BV-tilstand ), med højere niveauer af udvalgte metabolitter i det vaginale miljø (f.eks. inosin, fumarat, xanthin, benzoat, ascorbat)8 Recidiverende graviditetstab (RPL) defineres American Society for Reproductive Medicine som to eller flere spontane aborter før svangerskabsuge 22 ( ikke nødvendigvis fortløbende) Rollen af ​​vaginale infektioner i RPL er kontroversiel, og screening for infektioner anbefales ikke rutinemæssigt til patienter med RPL9

Vigtige immunceller i det humane endometrium omfatter uterine Natural Killer (uNK) celler, makrofager, dendritiske celler (DC'er) og T-celler. Hver af disse cellepopulationer viste en specifik rolle. uNK er involveret i succesen med implantation og vedligeholdelse af graviditet gennem deres evne til både at interagere gennem inhibitorreceptorer med HLA-G, HLA-E og HLA-C udtrykt på trofoblastceller og til at producere angiogene faktorer Kuon et al. i deres lille undersøgelse beskrevet at RPL-patienter med forhøjet pNK oftere lider af kolonisering af Gardnerella vaginalis og gram-negative anaerober. Dette kan indikere en sammenhæng mellem den vaginale mikrobiota, lokal inflammation, ændringer i immunparametre og abort.10 Ligesom det vaginale mikrobiom er endometriemikrobiomet normalt domineret af Lactobaciller. 11 En nylig undersøgelse illustrerede, at tilstedeværelsen af ​​et ikke-Lactobacillus-dominerende mikrobiom i endometrievæske hos IVF-patienter var forbundet med signifikant lavere implantations-, graviditets- og levendefødselsrater. 12 13 Ifølge forskning afspejler mikrobiotasammensætningen i endometrievæske ikke fuldt ud endometrievæv.14 Imidlertid har kun få undersøgelser direkte undersøgt mikroberne i livmodermiljøet, og hvordan disse mikrober kan påvirke implantation, størstedelen af ​​dem i IVF-cyklusser.

Abort i første trimester kan være forbundet med nedsat prævalens af Lactobacillus spp. og med ændringer i den relative overflod af flere bakterieslægter, herunder Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 og Lac_Roseburia 15 16

Chen W et al viste de relative forekomster af Actinobacteria og Fusobacteria i den såkaldte kronisk endometritis-gruppe på phylum-niveau. På slægtsniveau blev der observeret høje relative forekomster af Gardnerella i kronisk endometriose og ikke-graviditetsgrupper, hvilket signifikant refererede til det negative IVF-resultat17

Indstillinger og deltagere Alle patienter, der henvises til Assuta Ashdod universitetshospital på grund af RPL, der opfylder inklusionskriterierne, vil blive tilbudt rekruttering.

Inklusionskriterier omfatter:

• kvinder i alderen 18-40 år med to eller flere på hinanden følgende aborter.

Eksklusionskriterier vil omfatte:

• dokumenteret tidligere PID,
• tidligere historie med uterine misdannelser,
• patienter med hyperplasi og endometriecancer,
• patienter med spiral og antimikrobiel behandling i de foregående 4 uger.

Undersøgelsesmetoder og teknikker

Studere design

Efter at have indhentet informeret samtykke vil vi indsamle prøver fra 4 anatomiske steder: nederste tredjedel af vagina (før spekulumplacering), posterior fornix og cervikalkanal (efter steril spekulumplacering) og en prøve af tarmmikrobiom.

Prøvestørrelse - 20 kvinder for hver patologi i forskningsgruppen og 20 kvinders kontrolgruppe, dette svarer til andre undersøgelser om emnet 4.

Følgende data vil blive indsamlet fra lægejournaler:

• alder,
• etnicitet,
• BMI,
• Livsstil: tobaksbrug, Antal partnere inden for de seneste 6 måneder, kost, hygiejniske procedurer,
• Gynækologisk og obstetrisk historie: graviditet, paritet, menarche-tid, regelmæssighed af menstruationscyklus,
• Type og varighed af prævention,
• Symptomer: smerte, menometroragi,
• Sonografiske fund,

Prøver fra vagina, fornix og livmoderhalskanalen vil blive taget ved at indføre en flocket nylonpodning til skeden via et spekulum og cirkulær podning i 5-10 sekunder før brug af antiseptika. Der vil således blive udtaget i alt 160 prøver (3 patientgrupper (n=20*2) * 4 prøver).

Prøver vil blive lynfrosset ved -80°C og opbevaret indtil videre analyse. Batchede podningsprøver vil gennemgå mikrobiel DNA-ekstraktion ved brug af standardprotokoller fra Human Microbiome Project (HMP). Efter ekstraktion udføres en PCR-reaktion for 16S RNA-genamplifikation ved hjælp af HMP-primersæt. 16S amplikoner vil blive sekventeret ved hjælp af en Illumina næste generations sekventeringsplatforme (PE 250bpX2).

Sekvenseringsdata vil blive analyseret på Moran-Gilad lab, Ben-Gurion University. Bioinformatikanalysen vil være baseret på QIIME-softwarepakkens pipeline18. Kort fortalt vil mikrobiomdata blive analyseret ved hjælp af standardmetoder for sjældenhed, alfa- og beta-diversitet og overflod af taxa på forskellige taksonomiske niveauer. ANOVA-testen vil blive brugt til at bestemme, om OTU-relativ abundance er forskellig mellem prøver, G-testen for uafhængighed vil blive brugt til at bestemme sammenhæng mellem OTU tilstedeværelse/fravær med en specifik kategori, og signifikant variation mellem prøvegrupper vil blive analyseret ved hjælp af DESeq2 R pakke 19 på den rå ikke-normaliserede OTU-biometabel.

Rekrutteringsstrategi

Patienter vil blive rekrutteret fra ambulatoriet på Samson Assuta Universitetshospitalet i overensstemmelse med en protokol, der er under godkendelsesproces af det lokale Institutional Review Board (IRB).

Investigatoren vil informere patienten om undersøgelsen, dens formål og metode til randomisering af undersøgelsesgrupper. Patienter vil ikke blive lokket til at deltage i denne undersøgelse. Efterforskeren vil diskutere forudsigelige risici involveret, såvel som potentielle fordele, for hver undersøgelsesgruppe. Patienter, der har givet samtykke til at få deres oplysninger indhentet under undersøgelsen til analyse af resultaterne, vil til enhver tid have deres fortrolighed opretholdt ved hjælp af en undersøgelseskode som identifikator i forskningsdatabasen. Patienterne vil blive informeret af investigator om, at deres medicinske behandling ikke på nogen måde vil blive påvirket af deres beslutning om at deltage eller ej i undersøgelsen. Patienterne vil blive informeret om, at de kan vælge at trække sig fra undersøgelsen på et hvilket som helst tidspunkt uden at bringe yderligere medicinsk behandling i fare. En underskrevet og dateret informeret samtykke skal indhentes af investigator fra patienten før tilmelding til denne undersøgelse. Det originale underskrevne og daterede informationsark og patientens samtykke opbevares af investigator. En underskrevet kopi vil blive udleveret til patienten.

Statistisk analyse

Statistisk analyse vil blive udført ved hjælp af R-softwaremiljø til statistisk databehandling og grafik. Kategoriske variable data vil blive præsenteret ved hjælp af percentil, og statistisk signifikans vil blive testet ved hjælp af X² eller Fishers eksakte test, alt efter hvad der er relevant. Ordinalvariable data vil blive præsenteret ved hjælp af median og interkvartilområde, og statistisk signifikans vil blive analyseret ved hjælp af Mann Whitney test. Kontinuerlige variable data vil blive præsenteret ved hjælp af middelværdi og standardafvigelse, Student t test vil blive brugt til statistisk analyse

Etik

Denne undersøgelsesprotokol vil blive sendt til Assuta Ashdod University Hospitals etiske udvalg til godkendelse. Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med de etiske principper, der stammer fra Helsinki-deklarationen og GCP (ICH E6) og i overensstemmelse med lokale lovkrav. Deltageres identitet vil blive holdt fortrolig, og i det omfang det er tilladt i henhold til gældende love og/eller regler, vil de ikke blive gjort offentligt tilgængelige. Hvis undersøgelsesresultaterne offentliggøres, vil deltagernes identitet forblive fortrolig.

Informeret samtykke vil blive indhentet i overensstemmelse med ICH/GCP-retningslinjerne og Helsinki-erklæringen og vil blive implementeret før protokolspecifikke procedurer udføres. Risici og fordele ved at deltage i undersøgelsen vil blive mundtligt forklaret til hver potentiel deltager, inden samtykkeformularen underskrives i overensstemmelse med lokale lovkrav. Den underskrevne samtykkeerklæring vil blive opbevaret af investigator og en kopi udleveret til hver deltager.

Kildedokumentation

Investigatoren vil føre nøjagtige separate optegnelser over alle deltagernes indsamlede undersøgelsesdata, inklusive alle relevante undersøgelsesrelaterede oplysninger. Efterforskerne er forpligtet til grundig dokumentation af alle bivirkninger og uønskede hændelser i løbet af undersøgelsen i et bindemiddel til deltagerundersøgelsen, herunder eventuelle diagnostiske tests udført under undersøgelsen.

Al undersøgelsesdokumentation vil blive opbevaret i 15 år efter, at alle deltagere har gennemført og alle data er blevet indsamlet. IRB/IEC vil blive underrettet skriftligt om undersøgelsens afslutning og arkivstedet.