Att belysa mikrobiomet hos patienter med återkommande graviditetsförlust

Syfte Syftet med den aktuella studien är att utvärdera vaginal och intrauterin mikrobiota hos kvinnor med recurrent pregnancy loss (RPL) jämfört med normala kontroller. I slutändan skulle vi vilja bedöma om kvinnor med RPL har en karakteristisk mikrobiom som kan vara signifikant olika mikrobiota hos friska patienter i vår studiepopulation. Detta kan senare leda till behandling med en skräddarsydd mikrobiotatransplantationsmetod som involverar frisk vaginal mikrobiota för behandling av patienter med RPL och implementera den i en prospektiv randomiserad kontrollerad studie för att modulera mikrobiotan i fortplantningsorganen och uppnå ett förbättrat graviditetsresultat.

Bakgrund

Ett snabbt växande område inom biologisk forskning om människors hälsa och sjukdomar är forskningen inom mikrobiom. Mikrobiomet som bebor det kvinnliga fortplantningsorganet har länge misstänkts spela en viktig roll för hälsa och sjukdom. Aktuella teorier tyder på att förändrad mikrobiota även utan klinisk infektion kan utlösa ett inflammatoriskt svar i endometriet. Det påverkar framgången för embryoimplantation och framtida utveckling av graviditeten.5 De flesta studier handlar om mikrobiom i könsorganen hos patienter med upprepad implantationssvikt vid IVF, men vissa studier har också funnit förändrat mikrobiom hos patienter med återkommande graviditetsförlust (RPL)6 Vaginala och endometriella mikrobiotas kan vara oberoende. Endometrial mikrobiota har en rikare alfa-diversitet än vaginal mikrobiota, och dysbios av vaginal eller endometriemikrobiota kan orsaka implantationsfel. Till skillnad från tidigare rapporter rapporterar Ichiyama et al att Lactobacillus-frekvensen i slidan, men inte endometrium, kan vara en biomarkör för upprepad implantationsfel7 Små studier visade samband mellan spontan abort och onormal vaginal mikrobiom (60% mellanliggande flora, 20% BV-tillstånd ), med högre nivåer av utvalda metaboliter i den vaginala miljön (t.ex. inosin, fumarat, xantin, bensoat, askorbat)8 Recurrent pregnancy loss (RPL) definieras American Society for Reproductive medicine som två eller flera spontana missfall före graviditetsvecka 22 ( inte nödvändigtvis på varandra följande) Rollen av vaginala infektioner i RPL är kontroversiell och screening för infektioner rekommenderas inte rutinmässigt hos patienter med RPL9

Viktiga immunceller i det mänskliga endometriet inkluderar uterina Natural Killer (uNK) celler, makrofager, dendritiska celler (DCs) och T-celler. Var och en av dessa cellpopulationer visade en specifik roll. uNK är involverade i framgången med implantation och underhåll av graviditet genom sin förmåga att både interagera genom inhibitorreceptorer med HLA-G, HLA-E och HLA-C uttryckta på trofoblastceller och att producera angiogena faktorer Kuon et al i sin lilla studie som beskrevs att RPL-patienter med förhöjt pNK oftare lider av kolonisering av Gardnerella vaginalis och gramnegativa anaerober . Detta kan tyda på ett samband mellan vaginal mikrobiota, lokal inflammation, förändringar i immunparametrar och missfall.10 Liksom det vaginala mikrobiomet domineras livmoderslemhinnan vanligtvis av laktobaciller. 11 En nyligen genomförd undersökning illustrerade att närvaron av en icke-Lactobacillus-dominerande mikrobiom i endometrievätskan hos IVF-patienter var associerad med signifikant lägre implantations-, graviditets- och levande födelsetal. endometrievävnad.14 Men endast ett fåtal studier har direkt undersökt mikroberna i livmodermiljön och hur dessa mikrober kan påverka vid implantation, majoriteten av dem i IVF-cykler.

Första trimestern missfall kan associeras med minskad prevalens av Lactobacillus spp. och med förändringar i den relativa förekomsten av flera bakteriesläkten, inklusive Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 och Lac_Roseburia 15 16

Chen W et al visade de relativa förekomsterna av Actinobacteria och Fusobacteria i den så kallade kroniska endometritgruppen på filumnivå. På släktnivån observerades höga relativa förekomster av Gardnerella i grupperna kronisk endometrios och icke-graviditet, vilket signifikant refererade till det negativa IVF-utfallet17

Inställningar och deltagare Alla patienter som remitteras till Assuta Ashdod universitetssjukhus på grund av RPL, som uppfyller inklusionskriterierna, kommer att erbjudas rekrytering.

Inklusionskriterier inkluderar:

• kvinnor i åldern 18-40 år, med två eller flera missfall i följd.

Uteslutningskriterier inkluderar:

• dokumenterat tidigare PID,
• tidigare historia av livmodermissbildningar,
• patienter med hyperplasi och endometriecancer,
• patienter med spiral och antimikrobiell behandling under de föregående 4 veckorna.

Studera metodik och tekniker

Studera design

Efter att ha erhållit informerat samtycke kommer vi att samla in prover från fyra anatomiska platser: nedre tredjedelen av slidan (före spekulumplacering), posterior fornix och livmoderhalskanalen (efter steril spekulumplacering) och ett prov av tarmmikrobiom.

Provstorlek - 20 kvinnor för varje patologi i forskargruppen och 20 kvinnor i kontrollgruppen, detta liknar andra studier i ämnet 4.

Följande uppgifter kommer att samlas in från medicinska journaler:

• ålder,
• etnicitet,
• BMI,
• Livsstil: tobaksanvändning, antal partners under de senaste 6 månaderna, kost, hygieniska procedurer,
• Gynekologisk och obstetrisk historia: graviditet, paritet, menarchetid, menstruationscykelns regelbundenhet,
• Typ och varaktighet av preventivmedel,
• Symtom: smärta, menometroragi,
• Sonografiska fynd,

Prover från slidan, fornix och livmoderhalskanalen kommer att tas genom att introducera en flockad nylonpinne i slidan via ett spekulum och cirkulär svabbning i 5-10 sekunder innan du använder några antiseptika. Således kommer totalt 160 prover (3 patientgrupper (n=20*2) * 4 prover) att tas.

Prover kommer att snabbfrysas vid -80c och bevaras tills vidare analys. Batchade pinnprover kommer att genomgå mikrobiell DNA-extraktion med standardprotokoll från Human Microbiome Project (HMP). Efter extraktion kommer en PCR-reaktion för 16S RNA-genamplifiering att utföras med användning av HMP-primeruppsättningar. 16S amplikoner kommer att sekvenseras med hjälp av en Illumina nästa generations sekvenseringsplattformar (PE 250bpX2).

Sekvenseringsdata kommer att analyseras vid Moran-Gilad-labbet, Ben-Gurion University. Bioinformatikanalysen kommer att baseras på QIIME-programvarupaketets pipeline18. Kortfattat kommer mikrobiomdata att analyseras med hjälp av standardmetoder för sällsynthet, alfa- och betadiversitet och förekomst av taxa på olika taxonomiska nivåer. ANOVA-testet kommer att användas för att avgöra om OTU-relativ förekomst skiljer sig mellan prover, G-testet för oberoende kommer att användas för att bestämma sambandet mellan OTU-närvaro/frånvaro med en specifik kategori, och signifikant variation mellan provgrupper kommer att analyseras med DESeq2 R paket 19 på den råa icke-normaliserade OTU-biomtabellen.

Rekryteringsstrategi

Patienter kommer att rekryteras från polikliniken vid Samson Assuta Universitetssjukhuset i enlighet med ett protokoll som är under godkännandeprocess av den lokala institutionella granskningsnämnden (IRB).

Utredaren kommer att informera patienten om studien, dess syfte och metod för randomisering av studiegrupper. Patienter kommer inte att lockas att delta i denna studie. Utredaren kommer att diskutera förutsebara risker, såväl som potentiella fördelar, för varje studiegrupp. Patienter som har samtyckt till att få sin information inhämtad under studien för analys av resultaten kommer att få sin konfidentialitet upprätthållen hela tiden med hjälp av en studiekod som identifierare i forskningsdatabasen. Patienterna kommer att informeras av utredaren om att deras medicinska behandling inte på något sätt kommer att påverkas av deras beslut om att delta i studien eller inte. Patienterna kommer att informeras om att de kan välja att dra sig ur studien när som helst utan att äventyra ytterligare medicinsk vård. Ett undertecknat och daterat informerat samtycke måste erhållas av utredaren från patienten innan inskrivningen i denna studie. Det undertecknade och daterade informationsbladet i original och patientens samtycke kommer att bevaras av utredaren. En undertecknad kopia kommer att ges till patienten.

Statistisk analys

Statistisk analys kommer att utföras med hjälp av R mjukvarumiljö för statistisk beräkning och grafik. Kategorisk variabeldata kommer att presenteras med hjälp av percentil och statistisk signifikans kommer att testas med X² eller Fishers exakta test, beroende på vad som är lämpligt. Ordinalvariabeldata kommer att presenteras med median- och interkvartilintervall och statistisk signifikans kommer att analyseras med Mann Whitney-test. Kontinuerlig variabel data kommer att presenteras med medelvärde och standardavvikelse, Student t test kommer att användas för statistisk analys

Etik

Detta studieprotokoll kommer att skickas till Assuta Ashdod University Hospitals etiska kommitté för godkännande. Studien kommer att genomföras i enlighet med de etiska principer som härrör från Helsingforsdeklarationen och GCP (ICH E6) och i enlighet med lokala regulatoriska krav. Deltagarnas identitet kommer att hållas konfidentiell, och i den utsträckning det är tillåtet av tillämpliga lagar och/eller förordningar kommer de inte att göras allmänt tillgänglig. Om studieresultaten publiceras kommer deltagarnas identitet att förbli konfidentiell.

Informerat samtycke kommer att erhållas i enlighet med ICH/GCP-riktlinjer och Helsingforsdeklarationen och kommer att implementeras innan protokollspecifika procedurer genomförs. Riskerna och fördelarna med att delta i studien kommer att förklaras muntligt för varje potentiell deltagare innan samtyckesformuläret undertecknas i enlighet med lokala lagstadgade krav. Det undertecknade samtyckesformuläret kommer att behållas av utredaren och en kopia ges till varje deltagare.

Källdokumentation

Utredaren kommer att hålla exakta separata register över alla deltagares studiedata som samlats in, inklusive all relevant studierelaterad information. Utredarna har åtagit sig att noggrann dokumentera alla biverkningar och biverkningar under studien i en pärm för deltagande studie inklusive eventuella diagnostiska tester som utförts under studien.

All studiedokumentation kommer att bevaras i 15 år efter att alla deltagare har genomfört och all data har samlats in. IRB/IEC kommer att meddelas skriftligen om studiens slutförande och arkivets webbplats.