반복적인 임신 손실이 있는 환자의 마이크로바이옴 규명

목적 현재 연구의 목적은 정상 대조군과 비교하여 재발성 임신 손실(RPL)이 있는 여성의 질 및 자궁내 미생물군을 평가하는 것입니다. 궁극적으로 우리는 RPL을 가진 여성이 연구 모집단에서 건강한 환자의 미생물군과 크게 다를 수 있는 특징적인 미생물 군집을 가지고 있는지 평가하고 싶습니다. 이것은 나중에 RPL 환자의 치료를 위해 건강한 질 미생물군을 포함하는 맞춤형 미생물군 이식 접근법을 통한 치료로 이어질 수 있으며 생식관 미생물군을 조절하고 임신 결과를 달성하고 개선하기 위해 전향적 무작위 통제 시험에서 이를 구현할 수 있습니다.

배경

인간의 건강과 질병에 대한 생물학적 연구에서 빠르게 성장하는 분야는 마이크로바이옴 연구입니다. 여성 생식 기관에 서식하는 마이크로바이옴은 건강과 질병에 중요한 역할을 하는 것으로 오랫동안 의심되어 왔습니다. 현재 이론은 임상적 감염 없이도 변경된 미생물군이 자궁내막에서 염증 반응을 유발할 수 있다고 제안합니다. 그것은 배아 이식의 성공과 미래의 임신 발달에 영향을 미칩니다.5 대부분의 연구는 IVF에서 반복적인 착상 실패가 있는 환자의 생식기 미생물 군집을 다루지만, 일부 연구에서는 재발성 임신 손실(RPL)6 환자의 미생물 군집이 변경된 것으로 나타났습니다. 질 및 자궁내막 미생물총은 독립적일 수 있습니다. 자궁내막 미생물총은 질 미생물총보다 알파 ​​다양성이 더 풍부하며, 질 또는 자궁내막 미생물총의 세균불균형은 착상 실패를 유발할 수 있습니다. 이전 보고서와 달리 Ichiyama 등은 자궁내막이 아닌 질 내 락토바실러스 비율이 반복된 착상 실패의 바이오마커일 수 있다고 보고합니다.7 소규모 연구에서는 자연 유산과 비정상적인 질 미생물(중간 균총 60%, BV 조건 20%) 사이의 연관성을 보여주었습니다. ), 질 환경에서 더 높은 수준의 선택된 대사산물(예: 이노신, 푸마르산염, 크산틴, 벤조산염, 아스코르브산염)8 재발성 임신 손실(RPL)은 임신 22주 이전에 2회 이상의 자연 유산으로 미국 생식 의학 협회(American Society for Reproductive Medicine)로 정의됩니다( 반드시 연속적일 필요는 없음) RPL에서 질 감염의 역할은 논란의 여지가 있으며 감염 선별 검사는 RPL 환자에게 일상적으로 권장되지 않습니다9

인간 자궁내막의 주요 면역 세포에는 자궁 자연 살해(uNK) 세포, 대식세포, 수지상 세포(DC) 및 T 세포가 포함됩니다. 이러한 각 세포 집단은 특정한 역할을 보여주었습니다. uNK는 영양막 세포에서 발현되는 HLA-G, HLA-E 및 HLA-C와 억제제 수용체를 통해 상호 작용하고 혈관신생 인자를 생성하는 능력을 통해 착상 성공 및 임신 유지에 관여합니다. 증가된 pNK를 가진 RPL 환자는 Gardnerella vaginalis 및 그람 음성 혐기성 세균에 의한 집락화로 인해 더 자주 고통받습니다 . 이것은 질 미생물군, 국소 염증, 면역 매개변수의 변화 및 유산 사이의 연관성을 나타낼 수 있습니다.10 질 마이크로바이옴과 마찬가지로 자궁내막 마이크로바이옴은 일반적으로 락토바실러스에 의해 지배됩니다. 11 최근 연구에서는 IVF 환자의 자궁내막액에 락토바실러스가 지배적이지 않은 미생물 군집이 존재하는 것이 상당히 낮은 착상, 임신 및 출생률과 관련이 있다고 밝혔습니다. 12 13 연구에 따르면 자궁내막액의 미생물 구성은 자궁내막조직.14 그러나 자궁 환경 내의 미생물과 이러한 미생물이 착상에 미치는 영향을 직접 조사한 연구는 거의 없으며 대다수는 IVF 주기에 있습니다.

임신 1기 유산은 Lactobacillus spp.의 유병률 감소와 관련이 있을 수 있습니다. Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 및 Lac_Roseburia를 포함한 여러 세균 속의 상대적 풍부도의 변화와 함께 15 16

Chen W 등은 문 수준에서 소위 만성 자궁내막염 그룹에서 Actinobacteria 및 Fusobacteria의 상대적 존재비를 보여주었습니다. 부정적인 IVF 결과17

설정 및 참가자 포함 기준을 충족하는 RPL로 인해 Assuta Ashdod 대학 병원에 회부된 모든 환자에게 모집이 제공됩니다.

포함 기준은 다음과 같습니다.

• 18세에서 40세 사이의 여성으로 2회 이상 연속 유산합니다.

제외 기준에는 다음이 포함됩니다.

• 문서화된 과거 PID,
• 자궁 기형의 과거력,
• 과형성 및 자궁 내막 암 환자,
• 이전 4주 동안 IUD 및 항균 치료를 받은 환자.

연구 방법론 및 기술

연구 설계

정보에 입각한 동의를 얻은 후 우리는 4개의 해부학적 위치에서 샘플을 수집합니다: 질 하부 1/3(검경 배치 전), 후방 포닉스 및 자궁관(무균 검경 배치 후) 및 장내 미생물군집 샘플.

샘플 크기 - 연구 그룹의 각 병리학에 대해 20명의 여성과 20명의 여성 대조군, 이것은 주제 4에 대한 다른 연구와 유사합니다.

다음 데이터는 의료 기록에서 수집됩니다.

• 나이,
• 민족성,
• BMI,
• 라이프 스타일: 흡연, 지난 6개월 동안 파트너 수, 다이어트, 위생 절차,
• 부인과 및 산부인과 병력: 중력, 산모, 초경 시간, 월경 주기의 규칙성,
• 피임의 종류와 기간,
• 증상: 통증, 생리과다,
• 초음파 소견,

방부제를 사용하기 전에 5-10초 동안 검경과 원형 면봉을 통해 플록형 나일론 면봉을 질에 삽입하여 질, 포닉스 및 자궁경관의 샘플을 채취합니다. 따라서 총 160개의 샘플(3개의 환자 그룹(n=20*2) * 4개의 샘플)이 채취될 것이다.

샘플은 -80c에서 급속 동결되고 추가 분석까지 보관됩니다. 일괄 처리된 면봉 표본은 HMP(Human Microbiome Project)의 표준 프로토콜을 사용하여 미생물 DNA 추출을 거칩니다. 추출 후 HMP 프라이머 세트를 사용하여 16S RNA 유전자 증폭을 위한 PCR 반응을 수행합니다. 16S amplicon은 Illumina 차세대 시퀀싱 플랫폼(PE 250bpX2)을 사용하여 시퀀싱됩니다.

시퀀싱 데이터는 Ben-Gurion University의 Moran-Gilad 연구소에서 분석됩니다. 생물정보학 분석은 QIIME 소프트웨어 패키지 파이프라인18을 기반으로 합니다. 간단히 말해서, 마이크로바이옴 데이터는 다양한 분류학적 수준에서 희소성, 알파 및 베타 다양성 및 풍부한 분류군에 대한 표준 방법을 사용하여 분석됩니다. ANOVA 테스트는 OTU 상대적 풍부도가 샘플 간에 다른지 결정하는 데 사용되며, G 독립성 테스트는 OTU 존재/부재와 특정 범주의 연관성을 결정하는 데 사용되며, 샘플 그룹 간의 상당한 변동은 DESeq2 R을 사용하여 분석됩니다. 원시 비정규화 OTU 생물 테이블의 패키지 19.

채용 전략

지역 IRB(Institutional Review Board)의 승인 절차에 따라 Samson Assuta University Hospital의 외래 환자 클리닉에서 환자를 모집합니다.

연구자는 환자에게 연구, 그 목적 및 연구 그룹의 무작위화 방법에 대해 알려줄 것입니다. 환자는 이 연구에 참여하도록 부추기지 않을 것입니다. 연구자는 각 연구 그룹에 대한 잠재적 이익뿐만 아니라 관련된 예측 가능한 위험에 대해 논의할 것입니다. 결과 분석을 위해 연구 중에 정보를 얻는 데 동의한 환자는 연구 데이터베이스에서 연구 코드를 식별자로 사용하여 항상 기밀을 유지합니다. 연구 참여 여부에 대한 결정에 의해 환자의 의학적 치료가 어떤 식으로든 영향을 받지 않을 것임을 연구자가 환자에게 알릴 것입니다. 환자는 추가 의료 서비스를 위험에 빠뜨리지 않고 어느 단계에서든 연구를 중단할 수 있음을 알립니다. 본 연구에 등록하기 전에 연구자는 서명하고 날짜를 기입한 사전 동의를 환자로부터 얻어야 합니다. 서명 및 날짜가 기재된 원본 정보 시트와 환자 동의서는 연구원이 보관합니다. 서명된 사본이 환자에게 제공됩니다.

통계 분석

통계 분석은 통계 컴퓨팅 및 그래픽을 위한 R 소프트웨어 환경을 사용하여 수행됩니다. 범주형 변수 데이터는 백분위수를 사용하여 표시되며 통계적 유의성은 X² 또는 피셔의 정확 테스트를 적절하게 사용하여 테스트됩니다. 서수 변수 데이터는 중간 및 사분위수 범위를 사용하여 표시되고 통계적 유의성은 Mann Whitney 검정을 사용하여 분석됩니다. 연속 변수 데이터는 평균 및 표준 편차를 사용하여 표시되며, Student t 테스트는 통계 분석에 사용됩니다.

윤리학

이 연구 프로토콜은 승인을 위해 Assuta Ashdod 대학 병원 윤리 위원회에 제출됩니다. 이 연구는 헬싱키 및 GCP 선언(ICH E6)에서 비롯된 윤리 원칙과 현지 규제 요건을 준수하여 수행됩니다. 참가자의 신원은 기밀로 유지되며 해당 법률 및/또는 규정에서 허용하는 범위 내에서 공개되지 않습니다. 연구 결과가 발표되는 경우 참가자의 신원은 기밀로 유지됩니다.

사전 동의는 ICH/GCP 지침 및 헬싱키 선언에 따라 획득되며 프로토콜별 절차가 수행되기 전에 구현됩니다. 연구 참여의 위험과 이점은 현지 규제 법적 요구 사항에 따라 동의서에 서명하기 전에 각 잠재적 참가자에게 구두로 설명됩니다. 서명된 동의서는 조사자가 보관하고 각 참가자에게 사본을 제공합니다.

소스 문서

조사자는 모든 관련 연구 관련 정보를 포함하여 수집된 모든 참가자의 연구 데이터에 대한 정확한 개별 기록을 보관합니다. 조사관은 연구 중에 수행된 모든 진단 테스트를 포함하여 참가자 연구 바인더에 연구 중 모든 부작용 및 부작용을 철저히 문서화하기 위해 노력합니다.

모든 연구 문서는 모든 참가자가 완료하고 모든 데이터가 수집된 후 15년 동안 보관됩니다. IRB/IEC는 연구 완료 및 아카이브 사이트를 서면으로 통보받습니다.