Opheldering van het microbioom bij patiënten met terugkerend zwangerschapsverlies

Doelstellingen Het doel van de huidige studie is het evalueren van de vaginale en intra-uteriene microbiota bij vrouwen met recidiverend zwangerschapsverlies (RPL) in vergelijking met normale controles. Uiteindelijk willen we beoordelen of vrouwen met RPL een kenmerkend microbioom hebben dat significant kan verschillen van de microbiota van gezonde patiënten in onze studiepopulatie. Dit zou later kunnen leiden tot behandeling met een op maat gemaakte microbiota-transplantatiebenadering met gezonde vaginale microbiota voor de behandeling van patiënten met RPL en deze kunnen implementeren in een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde studie om de microbiota van het voortplantingsstelsel te moduleren en een beter zwangerschapsresultaat te bereiken.

Achtergrond

Een snel groeiend veld in biologisch onderzoek naar menselijke gezondheid en ziekte is dat van microbioomonderzoek. Er wordt al lang vermoed dat het microbioom in het vrouwelijke voortplantingsstelsel een belangrijke rol speelt bij gezondheid en ziekte. Huidige theorieën suggereren dat veranderde microbiota, zelfs zonder klinische infectie, een ontstekingsreactie in het endometrium kan veroorzaken. Het beïnvloedt het succes van de implantatie van embryo's en de toekomstige ontwikkeling van de zwangerschap.5 De meeste onderzoeken hebben betrekking op het microbioom van de geslachtsorganen bij patiënten met herhaaldelijk mislukte implantatie bij IVF, maar sommige onderzoeken hebben ook een veranderd microbioom gevonden bij patiënten met terugkerend zwangerschapsverlies (RPL)6 Vaginale en endometriale microbiota kunnen onafhankelijk zijn. Endometriale microbiota heeft een rijkere alfa-diversiteit dan vaginale microbiota, en dysbiose van vaginale of endometriale microbiota kan implantatiefalen veroorzaken. In tegenstelling tot eerdere rapporten, melden Ichiyama et al dat de Lactobacillus-snelheid in de vagina, maar niet in het endometrium, een biomarker kan zijn voor herhaald implantatiefalen. ), met hogere niveaus van geselecteerde metabolieten in de vaginale omgeving (bijv. inosine, fumaraat, xanthine, benzoaat, ascorbaat)8 Terugkerend zwangerschapsverlies (RPL) wordt door de American Society for Reproductive Medicine gedefinieerd als twee of meer spontane miskramen vóór zwangerschapsweek 22 ( niet noodzakelijkerwijs opeenvolgend) De rol van vaginale infecties bij RPL is controversieel en screening op infecties wordt niet routinematig aanbevolen bij patiënten met RPL9

De belangrijkste immuuncellen in het menselijk endometrium zijn uteriene Natural Killer (uNK)-cellen, macrofagen, dendritische cellen (DC's) en T-cellen. Elk van deze celpopulaties vertoonde een specifieke rol. uNK zijn betrokken bij het succes van de implantatie en het behoud van de zwangerschap door hun vermogen om via remmerreceptoren te interageren met HLA-G, HLA-E en HLA-C tot expressie gebracht op trofoblastcellen en om angiogene factoren te produceren die Kuon et al in hun kleine studie beschreven dat RPL-patiënten met verhoogde pNK vaker last hebben van kolonisatie door Gardnerella vaginalis en gramnegatieve anaeroben . Dit kan wijzen op een verband tussen de vaginale microbiota, lokale ontsteking, veranderingen in immuunparameters en miskraam.10 Net als het vaginale microbioom wordt het endometriummicrobioom meestal gedomineerd door Lactobacilli. 11 Een recent onderzoek illustreerde dat de aanwezigheid van een niet-Lactobacillus-dominerend microbioom in het endometriumvocht van IVF-patiënten geassocieerd was met significant lagere implantatie-, zwangerschaps- en levendgeboortecijfers. endometriumweefsel.14 Er zijn echter maar weinig onderzoeken die de microben in de baarmoederomgeving rechtstreeks hebben onderzocht en hoe deze microben de implantatie kunnen beïnvloeden, de meeste in IVF-cycli.

Een miskraam in het eerste trimester kan in verband worden gebracht met een verminderde prevalentie van Lactobacillus spp. en met veranderingen in de relatieve overvloed van verschillende bacteriegeslachten, waaronder Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 en Lac_Roseburia 15 16

Chen W et al toonden de relatieve hoeveelheden Actinobacteriën en Fusobacteriën in de zogenaamde chronische endometritis-groep op fylumniveau. Op geslachtsniveau werden hoge relatieve hoeveelheden Gardnerella waargenomen in de chronische endometriose- en niet-zwangerschapsgroepen, die significant de negatieve IVF-uitkomst17

Instellingen en deelnemers Alle patiënten die zijn doorverwezen naar het universitair ziekenhuis van Assuta Ashdod vanwege RPL en die voldoen aan de inclusiecriteria, krijgen werving aangeboden.

Inclusiecriteria zijn onder meer:

• vrouwen van 18-40 jaar oud, met twee of meer opeenvolgende miskramen.

Uitsluitingscriteria zijn onder meer:

• gedocumenteerd verleden PID,
• voorgeschiedenis van misvormingen van de baarmoeder,
• patiënten met hyperplasie en endometriumkanker,
• patiënten met een spiraaltje en antimicrobiële behandeling in de voorgaande 4 weken.

Methodologie en technieken bestuderen

Studie ontwerp

Na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming zullen we monsters verzamelen van 4 anatomische locaties: onderste derde deel van de vagina (vóór speculumplaatsing), achterste fornix en cervicaal kanaal (na steriele speculumplaatsing) en een monster van het darmmicrobioom.

Steekproefomvang - 20 vrouwen voor elke pathologie in de onderzoeksgroep en 20 vrouwelijke controlegroep, dit is vergelijkbaar met andere onderzoeken over dit onderwerp 4.

De volgende gegevens worden verzameld uit medische dossiers:

• leeftijd,
• etniciteit,
• BMI,
• Levensstijl: tabaksgebruik, aantal partners in de afgelopen 6 maanden, dieet, hygiënische procedures,
• Gynaecologische en verloskundige geschiedenis: graviditeit, pariteit, menarchetijd, regelmaat van de menstruatiecyclus,
• Type en duur van anticonceptie,
• Symptomen: pijn, menometrorragie,
• Echografische bevindingen,

Monsters van de vagina, fornix en het baarmoederhalskanaal worden genomen door een gevlokt nylon wattenstaafje in de vagina te brengen via een speculum en cirkelvormig wattenstaafje gedurende 5-10 seconden voordat antiseptica worden gebruikt. Er zullen dus in totaal 160 monsters (3 patiëntengroepen (n=20*2) * 4 monsters) worden genomen.

Monsters worden snel ingevroren bij -80°C en bewaard tot verdere analyse. Gegroepeerde uitstrijkjes ondergaan microbiële DNA-extractie met behulp van standaardprotocollen van het Human Microbiome Project (HMP). Na extractie zal een PCR-reactie voor 16S RNA-genamplificatie worden uitgevoerd met behulp van HMP-primersets. 16S-amplicons zullen worden gesequenced met behulp van een Illumina-sequencingplatform van de volgende generatie (PE 250bpX2).

Sequentiegegevens zullen worden geanalyseerd in het Moran-Gilad-lab, Ben-Gurion University. De bioinformatica-analyse zal worden gebaseerd op de QIIME-softwarepakketpijplijn18. In het kort zullen microbioomgegevens worden geanalyseerd met behulp van standaardmethoden voor verdunning, alfa- en bèta-diversiteit en abundantie van taxa op verschillende taxonomische niveaus. De ANOVA-test zal worden gebruikt om te bepalen of OTU relatieve abundantie verschilt tussen monsters, de G-test van onafhankelijkheid zal worden gebruikt om de associatie van OTU aanwezigheid/afwezigheid met een specifieke categorie te bepalen, en significante variatie tussen monstergroepen zal worden geanalyseerd met behulp van DESeq2 R pakket 19 op de onbewerkte niet-genormaliseerde OTU-biomtafel.

Wervingsstrategie

Patiënten zullen worden gerekruteerd uit de polikliniek van het Samson Assuta University Hospital in overeenstemming met een protocol dat wordt goedgekeurd door de lokale Institutional Review Board (IRB).

De onderzoeker zal de patiënt informeren over het onderzoek, het doel ervan en de methode van randomisatie van onderzoeksgroepen. Patiënten zullen niet worden overgehaald om deel te nemen aan dit onderzoek. De onderzoeker zal voor elke studiegroep de voorzienbare risico's en mogelijke voordelen bespreken. Patiënten die ermee hebben ingestemd dat hun informatie tijdens het onderzoek wordt verkregen voor analyse van de resultaten, zullen te allen tijde hun vertrouwelijkheid behouden met behulp van een onderzoekscode als identificatiemiddel in de onderzoeksdatabase. De patiënten zullen door de onderzoeker worden geïnformeerd dat hun medische behandeling op geen enkele manier zal worden beïnvloed door hun beslissing om al dan niet deel te nemen aan het onderzoek. Patiënten zullen worden geïnformeerd dat ze ervoor kunnen kiezen zich in elk stadium terug te trekken uit het onderzoek zonder verdere medische zorg in gevaar te brengen. Een ondertekende en gedateerde geïnformeerde toestemming moet door de onderzoeker van de patiënt worden verkregen voorafgaand aan deelname aan dit onderzoek. Het originele ondertekende en gedateerde informatieblad en de toestemming van de patiënt worden bewaard door de onderzoeker. De patiënt ontvangt een ondertekend exemplaar.

statistische analyse

Statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van de R-softwareomgeving voor statistische berekeningen en grafieken. Gegevens van categorische variabelen worden gepresenteerd met behulp van percentiel en statistische significantie wordt getest met behulp van de X²- of Fisher's exact-test, al naar gelang het geval. Ordinale variabele gegevens zullen worden gepresenteerd met behulp van mediaan en interkwartielbereik en statistische significantie zal worden geanalyseerd met behulp van de Mann Whitney-test. Continue variabele gegevens worden gepresenteerd met behulp van gemiddelde en standaarddeviatie, Student t-test zal worden gebruikt voor statistische analyse

Ethiek

Dit onderzoeksprotocol zal ter goedkeuring worden voorgelegd aan de ethische commissie van het Assuta Ashdod Universitair Ziekenhuis. Het onderzoek zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes die voortkomen uit de Verklaring van Helsinki en GCP (ICH E6) en in overeenstemming met de lokale wettelijke vereisten. De identiteit van de deelnemers zal vertrouwelijk worden behandeld en zal, voor zover toegestaan ​​door de toepasselijke wet- en/of regelgeving, niet openbaar worden gemaakt. Als de onderzoeksresultaten worden gepubliceerd, blijft de identiteit van de deelnemers vertrouwelijk.

Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen in overeenstemming met de ICH/GCP-richtlijnen en de Verklaring van Helsinki en zal worden geïmplementeerd voordat protocolspecifieke procedures worden uitgevoerd. De risico's en voordelen van deelname aan het onderzoek zullen mondeling aan elke potentiële deelnemer worden uitgelegd voordat het toestemmingsformulier wordt ondertekend in overeenstemming met de lokale wettelijke vereisten. Het ondertekende toestemmingsformulier wordt door de onderzoeker bewaard en een kopie wordt aan elke deelnemer verstrekt.

Brondocumentatie

De onderzoeker houdt nauwkeurig afzonderlijke gegevens bij van de verzamelde onderzoeksgegevens van alle deelnemers, inclusief alle relevante onderzoeksgerelateerde informatie. De onderzoekers zetten zich in voor een grondige documentatie van alle bijwerkingen en bijwerkingen tijdens het onderzoek in een studiemap voor deelnemers, inclusief eventuele diagnostische tests die tijdens het onderzoek zijn uitgevoerd.

Alle onderzoeksdocumentatie wordt gedurende 15 jaar bewaard nadat alle deelnemers de studie hebben voltooid en alle gegevens zijn verzameld. De IRB/IEC wordt schriftelijk op de hoogte gebracht van de voltooiing van de studie en de archiefsite.