Chiarire il microbioma nei pazienti con aborti ricorrenti

Obiettivi Lo scopo del presente studio è valutare il microbiota vaginale e intrauterino nelle donne con aborti ricorrenti (RPL) rispetto ai controlli normali. In definitiva, vorremmo valutare se le donne con RPL hanno un microbioma caratteristico che potrebbe essere un microbiota significativamente diverso di pazienti sani nella nostra popolazione di studio. Ciò potrebbe successivamente portare al trattamento con un approccio di trapianto di microbiota su misura che coinvolge il microbiota vaginale sano per il trattamento di pazienti con RPL e implementarlo in uno studio prospettico randomizzato controllato al fine di modulare il microbiota del tratto riproduttivo e ottenere e migliorare l'esito della gravidanza.

Sfondo

Un campo in rapida crescita nella ricerca biologica della salute e delle malattie umane è quello della ricerca sul microbioma. Da tempo si sospetta che il microbioma che abita il tratto riproduttivo femminile svolga un ruolo importante nella salute e nella malattia. Le attuali teorie suggeriscono che il microbiota alterato anche senza infezione clinica può innescare una risposta infiammatoria nell'endometrio. Colpisce il successo dell'impianto dell'embrione e lo sviluppo futuro della gravidanza.5 La maggior parte degli studi si occupa del microbioma del tratto genitale in pazienti con ripetuti fallimenti di impianto durante la fecondazione in vitro, tuttavia, alcuni studi hanno anche riscontrato un microbioma alterato in pazienti con aborti ricorrenti (RPL)6 Il microbiota vaginale e quello endometriale potrebbero essere indipendenti. Il microbiota endometriale ha una diversità alfa più ricca rispetto al microbiota vaginale e la disbiosi del microbiota vaginale o endometriale può causare il fallimento dell'impianto. A differenza dei precedenti rapporti, Ichiyama et al. riferiscono che il tasso di Lactobacillus nella vagina, ma non nell'endometrio, può essere un biomarcatore per ripetuti fallimenti di impianto7 Piccoli studi hanno mostrato un'associazione tra aborto spontaneo e microbioma vaginale anomalo (60% flora intermedia, 20% condizione BV ), con livelli più elevati di metaboliti selezionati nell'ambiente vaginale (ad es. inosina, fumarato, xantina, benzoato, ascorbato)8 L'aborto spontaneo ricorrente (RPL) è definito dall'American Society for Reproductive medicine come due o più aborti spontanei prima della settimana gestazionale 22 ( non necessariamente consecutivi) Il ruolo delle infezioni vaginali nella RPL è controverso e lo screening per le infezioni non è raccomandato di routine nelle pazienti con RPL9

Le principali cellule immunitarie nell'endometrio umano includono cellule Natural Killer (uNK) uterine, macrofagi, cellule dendritiche (DC) e cellule T. Ognuna di queste popolazioni cellulari ha dimostrato un ruolo specifico. uNK sono coinvolti nel successo dell'impianto e nel mantenimento della gravidanza grazie alla loro capacità sia di interagire attraverso i recettori inibitori con HLA-G, HLA-E e HLA-C espressi sulle cellule del trofoblasto sia di produrre fattori angiogenici Kuon et al nel loro piccolo studio descritto che i pazienti RPL con pNK elevato soffrono più spesso di colonizzazione da parte di Gardnerella vaginalis e anaerobi gram-negativi. Ciò potrebbe indicare un'associazione tra il microbiota vaginale, l'infiammazione locale, i cambiamenti nei parametri immunitari e l'aborto spontaneo.10 Come il microbioma vaginale, il microbioma endometriale è solitamente dominato dai lattobacilli. 11 Uno studio recente ha dimostrato che la presenza di un microbioma non dominante nel Lactobacillus nel fluido endometriale delle pazienti con fecondazione in vitro era associata a tassi di impianto, gravidanza e nati vivi significativamente inferiori 12 13 Secondo le ricerche, la composizione del microbiota nel fluido endometriale non riflette pienamente quella tessuto endometriale.14 Tuttavia, solo pochi studi hanno sondato direttamente i microbi all'interno dell'ambiente uterino e come questi microbi potrebbero influenzare l'impianto, la maggior parte dei quali nei cicli di fecondazione in vitro.

L'aborto spontaneo del primo trimestre può essere associato a una ridotta prevalenza di Lactobacillus spp. e con cambiamenti nell'abbondanza relativa di diversi generi batterici, tra cui Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 e Lac_Roseburia 15 16

Chen W et al. hanno mostrato le abbondanze relative di Actinobacteria e Fusobacteria nel cosiddetto gruppo dell'endometrite cronica a livello di phylum. l'esito negativo della FIV17

Impostazioni e partecipanti A tutti i pazienti indirizzati all'ospedale universitario Assuta Ashdod a causa di RPL, che soddisfano i criteri di inclusione, verrà offerto il reclutamento.

I criteri di inclusione includono:

• donne di età compresa tra 18 e 40 anni, con due o più aborti consecutivi.

I criteri di esclusione includeranno:

• PID passato documentato,
• precedente storia di malformazioni uterine,
• pazienti con iperplasia e cancro dell'endometrio,
• pazienti con IUD e trattamento antimicrobico nelle 4 settimane precedenti.

Metodologia e tecniche di studio

Progettazione dello studio

Dopo aver ottenuto il consenso informato, raccoglieremo campioni da 4 sedi anatomiche: terzo inferiore della vagina (prima del posizionamento dello speculum), fornice posteriore e canale cervicale (dopo il posizionamento dello speculum sterile) e un campione di microbioma intestinale.

Dimensione del campione - 20 donne per ogni patologia nel gruppo di ricerca e 20 donne nel gruppo di controllo, questo è simile ad altri studi sull'argomento 4.

Dalla cartella clinica verranno raccolti i seguenti dati:

• età,
• etnia,
• indice di massa corporea,
• Stile di vita: consumo di tabacco, numero di partner negli ultimi 6 mesi, dieta, procedure igieniche,
• Anamnesi ginecologica e ostetrica: gravidità, parità, tempo del menarca, regolarità del ciclo mestruale,
• Tipo e durata della contraccezione,
• Sintomi: dolore, menometrorragia,
• Reperti ecografici,

Verranno prelevati campioni dalla vagina, dal fornice e dal canale cervicale introducendo un tampone di nylon floccato nella vagina tramite uno speculum e un tampone circolare per 5-10 secondi prima di utilizzare qualsiasi antisettico. Verranno quindi prelevati un totale di 160 campioni (3 gruppi di pazienti (n=20*2) * 4 campioni).

I campioni saranno congelati istantaneamente a -80°C e conservati fino a ulteriori analisi. I campioni di tampone in lotti saranno sottoposti all'estrazione del DNA microbico utilizzando i protocolli standard del Progetto Microbioma Umano (HMP). Dopo l'estrazione, verrà eseguita una reazione di PCR per l'amplificazione del gene 16S RNA utilizzando set di primer HMP. Gli ampliconi 16S saranno sequenziati utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione Illumina (PE 250bpX2).

I dati di sequenziamento saranno analizzati presso il laboratorio Moran-Gilad, Ben-Gurion University. L'analisi bioinformatica sarà basata sulla pipeline del pacchetto software QIIME18. In breve, i dati del microbioma saranno analizzati utilizzando metodi standard per rarefazione, diversità alfa e beta e abbondanza di taxa a diversi livelli tassonomici. Il test ANOVA verrà utilizzato per determinare se l'abbondanza relativa di OTU è diversa tra i campioni, il test di indipendenza G verrà utilizzato per determinare l'associazione della presenza/assenza di OTU con una categoria specifica e la variazione significativa tra i gruppi di campioni verrà analizzata utilizzando DESeq2 R pacchetto 19 sulla tabella biom OTU grezza non normalizzata.

Strategia di reclutamento

I pazienti verranno reclutati dalla clinica ambulatoriale presso l'ospedale universitario Samson Assuta in conformità con un protocollo che è in fase di approvazione da parte dell'Institutional Review Board (IRB) locale.

Lo sperimentatore informerà il paziente sullo studio, sul suo scopo e sul metodo di randomizzazione dei gruppi di studio. I pazienti non saranno persuasi a partecipare a questo studio. Lo sperimentatore discuterà i rischi prevedibili coinvolti, nonché i potenziali benefici, per ciascun gruppo di studio. I pazienti che hanno acconsentito all'ottenimento delle loro informazioni durante lo studio per l'analisi dei risultati manterranno la loro riservatezza in ogni momento utilizzando un codice dello studio come identificatore nel database di ricerca. I pazienti saranno informati dallo Sperimentatore che il loro trattamento medico non sarà influenzato in alcun modo dalla loro decisione se partecipare o meno allo studio. I pazienti saranno informati che possono scegliere di ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento senza compromettere ulteriori cure mediche. Un consenso informato firmato e datato deve essere ottenuto dallo sperimentatore dal paziente prima dell'arruolamento in questo studio. Il foglio informativo originale firmato e datato e il consenso del paziente saranno conservati dallo sperimentatore. Una copia firmata verrà consegnata al paziente.

analisi statistica

L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando l'ambiente software R per il calcolo statistico e la grafica. I dati delle variabili categoriche saranno presentati utilizzando il percentile e la significatività statistica sarà testata utilizzando l'X² o il test esatto di Fisher, a seconda dei casi. I dati delle variabili ordinali saranno presentati utilizzando la mediana e l'intervallo interquartile e la significatività statistica sarà analizzata utilizzando il test di Mann Whitney. I dati variabili continue saranno presentati utilizzando la media e la deviazione standard, il test t di Student sarà utilizzato per l'analisi statistica

Etica

Questo protocollo di studio sarà sottoposto al comitato etico dell'Assuta Ashdod University Hospital per l'approvazione. Lo studio sarà condotto in conformità con i principi etici originati dalla Dichiarazione di Helsinki e GCP (ICH E6) e in conformità con i requisiti normativi locali. L'identità dei partecipanti sarà mantenuta riservata e, nella misura consentita dalle leggi e/o dai regolamenti applicabili, non sarà resa pubblica. Se i risultati dello studio vengono pubblicati, l'identità dei partecipanti rimarrà riservata.

Il consenso informato sarà ottenuto in conformità con le linee guida ICH/GCP e la Dichiarazione di Helsinki e sarà implementato prima che vengano eseguite le procedure specifiche del protocollo. I rischi e i benefici della partecipazione allo studio saranno spiegati verbalmente a ciascun potenziale partecipante prima di firmare il modulo di consenso in conformità con i requisiti legali normativi locali. Il modulo di consenso firmato sarà conservato dallo sperimentatore e una copia fornita a ciascun partecipante.

Documentazione di origine

Lo sperimentatore conserverà registri separati e accurati di tutti i dati di studio raccolti dai partecipanti, comprese tutte le informazioni pertinenti relative allo studio. Gli investigatori si impegnano a documentare in modo approfondito tutti gli effetti collaterali e gli eventi avversi durante lo studio in un raccoglitore dello studio partecipante, inclusi eventuali test diagnostici condotti durante lo studio.

Tutta la documentazione dello studio verrà conservata per 15 anni dopo che tutti i partecipanti avranno completato e tutti i dati saranno stati raccolti. L'IRB/IEC sarà informato per iscritto del completamento dello studio e del sito di archiviazione.