Elucidando o microbioma em pacientes com perdas recorrentes de gravidez

Objetivos O objetivo do presente estudo é avaliar a microbiota vaginal e intra-uterina em mulheres com perdas gestacionais recorrentes (PPR) em comparação com controles normais. Em última análise, gostaríamos de avaliar se as mulheres com RPL têm um microbioma característico que pode ser uma microbiota significativamente diferente de pacientes saudáveis ​​em nossa população de estudo. Posteriormente, isso poderia levar ao tratamento com uma abordagem de transplante de microbiota personalizada envolvendo microbiota vaginal saudável para o tratamento de pacientes com RPL e implementá-lo em um estudo prospectivo randomizado controlado para modular a microbiota do trato reprodutivo e obter um melhor resultado da gravidez.

Fundo

Um campo em rápido crescimento na pesquisa biológica da saúde e doença humana é a pesquisa do microbioma. Há muito se suspeita que o microbioma que habita o trato reprodutivo feminino desempenha um papel importante na saúde e na doença. As teorias atuais sugerem que a microbiota alterada mesmo sem infecção clínica pode desencadear uma resposta inflamatória no endométrio. Afeta o sucesso da implantação do embrião e o desenvolvimento futuro da gravidez.5 A maioria dos estudos lida com o microbioma do trato genital em pacientes com falhas repetidas de implantação na fertilização in vitro, no entanto, alguns estudos também encontraram microbioma alterado em pacientes com perda gestacional recorrente (RPL)6 As microbiotas vaginal e endometrial podem ser independentes. A microbiota endometrial tem uma diversidade alfa mais rica do que a microbiota vaginal, e a disbiose da microbiota vaginal ou endometrial pode causar falha na implantação. Ao contrário de relatórios anteriores, Ichiyama et al relata que a taxa de Lactobacillus na vagina, mas não no endométrio, pode ser um biomarcador para falhas repetidas de implantação7 Pequenos estudos mostraram associação entre aborto espontâneo e microbioma vaginal anormal (60% flora intermediária, 20% condição BV ), com níveis mais altos de metabólitos selecionados no ambiente vaginal (por exemplo, inosina, fumarato, xantina, benzoato, ascorbato). não necessariamente consecutivos) O papel das infecções vaginais em RPL é controverso e a triagem para infecções não é recomendada rotineiramente em pacientes com RPL9

As principais células imunes no endométrio humano incluem células uterinas Natural Killer (uNK), macrófagos, células dendríticas (DCs) e células T. Cada uma dessas populações de células demonstrou um papel específico. As uNK estão envolvidas no sucesso da implantação e manutenção da gravidez por meio de sua capacidade de interagir através de receptores inibidores com HLA-G, HLA-E e HLA-C expressos em células trofoblásticas e de produzir fatores angiogênicos Kuon et al em seu pequeno estudo descrito que pacientes RPL com pNK elevado sofrem mais frequentemente de colonização por Gardnerella vaginalis e anaeróbios gram-negativos. Isso pode indicar uma associação entre a microbiota vaginal, inflamação local, alterações nos parâmetros imunológicos e aborto espontâneo.10 Assim como o microbioma vaginal, o microbioma endometrial geralmente é dominado por lactobacilos. 11 Estudos recentes ilustraram que a presença de um microbioma não dominante de Lactobacillus no fluido endometrial de pacientes de fertilização in vitro foi associada a taxas significativamente mais baixas de implantação, gravidez e nascidos vivos 12 13 De acordo com pesquisas, a composição da microbiota no fluido endometrial não reflete totalmente isso em tecido endometrial.14 No entanto, poucos estudos investigaram diretamente os micróbios no ambiente uterino e como esses micróbios poderiam influenciar na implantação, a maioria deles em ciclos de fertilização in vitro.

O aborto espontâneo no primeiro trimestre pode estar associado à prevalência reduzida de Lactobacillus spp. e com mudanças na abundância relativa de vários gêneros bacterianos, incluindo Fam_Finegoldia, Lac_Coprococcus_3 e Lac_Roseburia 15 16

Chen Wet al mostrou as abundâncias relativas de Actinobacteria e Fusobacteria no chamado grupo de endometrite crônica em nível de filo. o resultado negativo da fertilização in vitro 17

Cenários e participantes Todos os pacientes encaminhados ao hospital universitário Assuta Ashdod devido a RPL, atendendo aos critérios de inclusão, serão recrutados.

Os critérios de inclusão incluem:

• mulheres de 18 a 40 anos, com dois ou mais abortos espontâneos consecutivos.

Os critérios de exclusão incluirão:

• PID passado documentado,
• história prévia de malformações uterinas,
• pacientes com hiperplasia e câncer de endométrio,
• pacientes com DIU e tratamento antimicrobiano nas últimas 4 semanas.

Metodologia e técnicas de estudo

Design de estudo

Após obter o consentimento informado, coletaremos amostras de 4 locais anatômicos: terço inferior da vagina (antes da colocação do espéculo), fórnice posterior e canal cervical (após a colocação do espéculo estéril) e uma amostra do microbioma intestinal.

Tamanho da amostra - 20 mulheres para cada patologia no grupo de pesquisa e 20 mulheres no grupo controle, isso é semelhante a outros estudos sobre o assunto 4.

Os seguintes dados serão coletados dos prontuários médicos:

• idade,
• etnia,
• IMC,
• Estilo de vida: uso de tabaco, número de parceiros nos últimos 6 meses, dieta, procedimentos higiênicos,
• História ginecológica e obstétrica: gravidez, paridade, tempo de menarca, regularidade do ciclo menstrual,
• Tipo e duração da contracepção,
• Sintomas: dor, menometrorragia,
• Achados ultrassonográficos,

Amostras da vagina, fórnice e canal cervical serão coletadas pela introdução de um swab de náilon flocado na vagina por meio de um espéculo e esfregaço circular por 5 a 10 segundos antes de usar qualquer anti-séptico. Assim, um total de 160 amostras (3 grupos de pacientes (n=20*2) * 4 amostras) serão coletadas.

As amostras serão congeladas a -80°C e mantidas até análise posterior. Amostras de swab em lote serão submetidas à extração de DNA microbiano usando protocolos padrão do Human Microbiome Project (HMP). Após a extração, uma reação de PCR para amplificação do gene 16S RNA será realizada usando conjuntos de primers HMP. Os amplicons 16S serão sequenciados usando uma plataforma de sequenciamento de última geração Illumina (PE 250bpX2).

Os dados de sequenciamento serão analisados ​​no laboratório Moran-Gilad, Ben-Gurion University. A análise bioinformática será baseada no pacote de software QIIME18. Resumidamente, os dados do microbioma serão analisados ​​usando métodos padrão para rarefação, diversidade alfa e beta e abundância de táxons em diferentes níveis taxonômicos. O teste ANOVA será usado para determinar se a abundância relativa de OTU é diferente entre as amostras, o teste G de independência será usado para determinar a associação da presença/ausência de OTU com uma categoria específica e a variação significativa entre grupos de amostra será analisada usando DESeq2 R pacote 19na tabela biom OTU não normalizada bruta.

Estratégia de recrutamento

Os pacientes serão recrutados no ambulatório do Samson Assuta University Hospital de acordo com um protocolo que está em processo de aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) local.

O investigador informará o paciente sobre o estudo, seu objetivo e método de randomização dos grupos de estudo. Os pacientes não serão persuadidos a participar deste estudo. O Investigador discutirá os riscos previsíveis envolvidos, bem como os benefícios potenciais, para cada grupo de estudo. Os pacientes que consentirem em obter suas informações durante o estudo para análise dos resultados terão sua confidencialidade mantida em todos os momentos usando um código do estudo como identificador no banco de dados da pesquisa. Os pacientes serão informados pelo Investigador de que seu tratamento médico não será afetado de forma alguma por sua decisão de participar ou não do estudo. Os pacientes serão informados de que podem optar por desistir do estudo a qualquer momento sem comprometer qualquer tratamento médico adicional. Um consentimento informado assinado e datado deve ser obtido pelo investigador do paciente antes da inscrição neste estudo. A folha de informações original assinada e datada e o consentimento do paciente serão mantidos pelo Investigador. Uma cópia assinada será fornecida ao paciente.

Análise estatística

A análise estatística será realizada utilizando o ambiente de software R para computação estatística e gráficos. Dados de variáveis ​​categóricas serão apresentados por meio de percentil e a significância estatística será testada por meio do teste X² ou exato de Fisher, conforme apropriado. Dados de variáveis ​​ordinais serão apresentados por meio de mediana e intervalo interquartílico e a significância estatística será analisada por meio do teste de Mann Whitney. Dados de variáveis ​​contínuas serão apresentados por meio de média e desvio padrão, teste t de Student será usado para análise estatística

Ética

Este protocolo de estudo será submetido ao comitê de ética do Hospital Universitário Assuta Ashdod para aprovação. O estudo será conduzido de acordo com os princípios éticos originados na Declaração de Helsinki e GCP (ICH E6) e em conformidade com os requisitos regulatórios locais. A identidade dos participantes será mantida em sigilo e, na medida do permitido pelas leis e/ou regulamentos aplicáveis, não será disponibilizada ao público. Se os resultados do estudo forem publicados, a identidade dos participantes permanecerá confidencial.

O consentimento informado será obtido de acordo com as Diretrizes ICH/GCP e a Declaração de Helsinki e será implementado antes da execução dos procedimentos específicos do protocolo. Os riscos e benefícios da participação no estudo serão explicados verbalmente a cada potencial participante antes da assinatura do formulário de consentimento, de acordo com os requisitos legais regulatórios locais. O formulário de consentimento assinado será retido pelo investigador e uma cópia fornecida a cada participante.

Documentação de origem

O investigador manterá registros precisos e separados de todos os dados do estudo dos participantes coletados, incluindo todas as informações pertinentes relacionadas ao estudo. Os investigadores estão comprometidos com a documentação completa de todos os efeitos colaterais e eventos adversos durante o estudo em um fichário do estudo do participante, incluindo quaisquer testes de diagnóstico realizados durante o estudo.

Toda a documentação do estudo será mantida por 15 anos após a conclusão de todos os participantes e a coleta de todos os dados. O IRB/IEC será notificado por escrito da conclusão do estudo e do local de arquivo.