Role tvorby cév typu H v indukované membráně pacientů s kritickým defektem kosti

Masquelet technika, také nazývaná indukovaná membránová technika (IMT), byla poprvé představena k léčbě kritického kostního defektu velikosti až 25 cm v roce 1986 Pr. Alain Charles Masquelet a kol. IMT je dvoufázová chirurgická operace, která v poslední době poskytuje populárnější možnost léčby kostního defektu kritické velikosti i neshojení zlomeniny. V zásadě první stupeň IMT zahrnuje implantaci polymethylmetakrylátového (PMMA) cementového spaceru naplněného antibiotiky do místa defektu. Během 6 až 8 týdnů tento spacer indukuje tvorbu a zrání tenké vrstvy zvané indukovaná membrána, která jej obklopuje prostřednictvím imunitní reakce na cizí těleso. Ve stadiu II se spacer opatrně odstraní, přičemž se indukovaná membrána ponechá v místě zlomeniny, poté se provede autologní kostní štěp k vyvolání hojení kosti. IMT má několik příznivých účinků, včetně relativně jednoduchého řízení oproti vaskularizovaným fibulárním štěpům a žádného významného rozdílu v době hojení mezi různými velikostmi defektů. Je třeba poznamenat, že mnohočetné operace a dlouhá doba zotavení jsou obtíže, které je třeba u pacientů léčených IMT překonat. Vzhledem k tomu, že indukovaná membrána byla považována za nepostradatelnou součást úspěšného spojení, její podrobnější a komplexnější analýza zlepší proces IMT ke zmírnění těchto potíží.

Návrh klinické studie se bude řídit popisem v institucionální kontrolní radě nadace Chang Gung Medical Foundation, která bude zahájena v prvním roce, dokud nebude dosaženo počtu 15 pacientů pro každou skupinu. Stručně řečeno, pacienti s otevřenou zlomeninou budou náhodně rozděleni do dvou skupin, aby se snížil výběr bios, zahrnujících spacer (s indukovanou membránou) a skupiny bez spaceru (bez indukované membrány). Ve skupině bez spaceru (bez operace ve stádiu I) se odeberou měkké tkáně v blízkosti míst zlomeniny o velikosti 1 cm2, které se použijí jako vhodná kontrola indukované membrány (1 cm2) ze skupiny s spacerem (fáze I + II ) v časovém bodě II. etapy IMT. Tkáně budou rozřezány na tři části pro proteomiku, metabolomiku a parafinizované řezy, skladované před experimenty při minus 80 stupních. Tato část je v tomto projektu nezbytná k charakterizaci tvorby cév typu H a schopnosti hojení kosti. Za tímto účelem bude provedena imunohistochemie (IHC) nebo imunofluorescence (IF) k měření identifikovaných proteinů z výsledků proteomiky jak v měkkých tkáních, tak v indukované membráně. Charakterizované markery obsahující shluk diferenciace 31 (CD31) a endomucin (Emcn) budou použity k detekci cév typu H. K odhalení histologických náhledů na indukovanou membránu lze také použít kolorimetrické metody včetně Massonova trichromu, alciánské modři, alizarinové červeně S, H&E a safraninové O-Fast zelené. V multi-omicích budou tkáně použity k odhalení nových cílů, které budou následně porovnány s hladinami vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) a osteokalcinu. Dále bude proveden western blotting a reverzní transkriptáza-polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) v reálném čase, aby se ověřila downstream regulace identifikovaných metabolitů.

Žilní krev (3 ml do vacutainerů s heparinem) bude odebrána oběma skupinám na oddělení ortopedické chirurgie, Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Taiwan. Protokol byl založen na zprávě identifikující VEGF jako potenciální biomarker spojení v IMT. Po odběru bude krev centrifugována (1000 ot./min., 10 minut při pokojové teplotě) po dobu 30 minut a skladována při minus 80 stupních až do analýzy. Vzorky krve z časového bodu odběru indukované membrány jsou připraveny pro multi-omickou analýzu k identifikaci systémových markerů pro cévu typu H nebo indukovanou membránu a VEGF a osteokalcin budou použity jako sérové ​​indikátory pro kostní hmotu. Vzorky krve ze všech časových bodů budou použity k identifikaci nového biomarkeru pro cévy typu H a hojení kostí. Co se týče metabolitových cílů, k jejich ověření v krvi budou použity cílené metody metabolomiky. Časové body pro odběr vzorků krve ve stádiu I budou den operace, následující den operace a 1, 2 a 4 týdny po operaci. Pokud jde o fázi II, časové body budou den operace, následující den operace a 1, 2, 12 a 14 týdnů po operaci.