Il ruolo della formazione di vasi di tipo H nella membrana indotta di pazienti con difetto osseo di dimensioni critiche

La tecnica del masquelet, chiamata anche tecnica a membrana indotta (IMT), è stata introdotta per la prima volta per il trattamento di difetti ossei di dimensioni critiche fino a 25 cm nel 1986 dal prof. Alain Charles Masquelet et al. L'IMT è un'operazione chirurgica in due fasi che recentemente fornisce un'opzione più popolare per il trattamento del difetto osseo di dimensioni critiche e del mancato consolidamento delle fratture. Fondamentalmente, la prima fase dell'IMT comprende l'impianto di un distanziatore di cemento in polimetilmetacrilato (PMMA) caricato con antibiotici nel sito del difetto. Durante 6-8 settimane, questo distanziatore induce la formazione e la maturazione di uno strato sottile chiamato membrana indotta che lo circonda attraverso una risposta immunitaria da corpo estraneo. Nella fase II, lo spaziatore viene accuratamente rimosso mantenendo la membrana indotta nel sito della frattura, quindi viene eseguito un innesto osseo autologo per provocare la guarigione ossea. L'IMT conferisce diversi effetti benefici tra cui la gestione relativamente semplice rispetto agli innesti fibulari vascolarizzati e nessuna differenza significativa nel tempo di guarigione tra le varie dimensioni del difetto. Da notare, interventi chirurgici multipli e lunghi tempi di recupero sono le difficoltà ancora da superare nei pazienti trattati con IMT. In considerazione del fatto che la membrana indotta è stata considerata una componente indispensabile per un'unione di successo, un'analisi più dettagliata e completa di essa migliorerà il processo di IMT per migliorare tali difficoltà.

Il disegno dello studio clinico seguirà la descrizione in Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board, che sarà avviato nel primo anno fino al raggiungimento di 15 pazienti per ciascun gruppo. In breve, i pazienti con frattura esposta saranno divisi casualmente in due gruppi per ridurre il bios di selezione, comprendente gruppi spaziatori (con membrana indotta) e senza gruppi spaziatori (senza membrana indotta). In un gruppo senza spaziatore (Nessuna operazione dello stadio I), i tessuti molli vicino ai siti di frattura con una dimensione di 1 cm2 saranno raccolti per essere utilizzati come controllo appropriato della membrana indotta (1 cm2) dal gruppo spaziatore (Stadio I + II ) al punto temporale della fase II dell'IMT. I tessuti saranno sezionati in tre parti per la proteomica, la metabolomica e la sezione paraffinata, conservate a meno 80 gradi prima degli esperimenti. La sezione è fondamentale in questo progetto per caratterizzare la formazione di vasi di tipo H e la capacità di guarigione ossea. A questo scopo, l'immunoistochimica (IHC) o l'immunofluorescenza (IF) saranno eseguite per misurare le proteine ​​identificate dai risultati della proteomica sia nei tessuti molli che nella membrana indotta. I marcatori caratterizzati comprendenti il ​​cluster di differenziazione 31 (CD31) e l'endomucina (Emcn) saranno utilizzati per rilevare i vasi di tipo H. Possono anche essere eseguiti metodi colorimetrici tra cui il tricromico di Masson, il blu di Alcian, il rosso di alizarina S, H&E e il verde di Safranin O-Fast per svelare intuizioni istologiche della membrana indotta. Nella multi-omica, i tessuti verranno utilizzati per svelare nuovi bersagli, che verranno poi confrontati con i livelli del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e dell'osteocalcina. Inoltre, saranno eseguiti western blotting e reazione a catena della polimerasi inversa in tempo reale (RT-PCR) per validare la regolazione a valle dei metaboliti identificati.

Il sangue venoso (3 ml in vacutainer con eparina) sarà raccolto da entrambi i gruppi presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Taiwan. Il protocollo si basava su un rapporto che identificava il VEGF come potenziale biomarcatore dell'unione nell'IMT. Dopo il prelievo, il sangue verrà centrifugato (1000 RPM, 10 minuti a temperatura ambiente) per 30 minuti e conservato a meno 80 gradi fino all'analisi. I campioni di sangue dal momento della raccolta della membrana indotta vengono preparati per l'analisi multi-omica per identificare marcatori sistemici per vaso di tipo H o membrana indotta, e VEGF e osteocalcina saranno utilizzati come indicatori sierici per la massa ossea. I campioni di sangue di tutti i punti temporali verranno utilizzati per identificare un nuovo biomarcatore per i vasi di tipo H e la guarigione ossea. Per quanto riguarda i bersagli metabolici, verranno impiegati metodi mirati di metabolomica per verificarli nel sangue. I punti temporali per la raccolta dei campioni di sangue della fase I saranno il giorno dell'intervento, il giorno successivo dell'intervento e 1, 2 e 4 settimane dopo l'intervento. Per quanto riguarda la fase II, i punti temporali saranno il giorno dell'intervento, il giorno successivo all'intervento e 1, 2, 12 e 14 settimane dopo l'intervento.