Rola tworzenia naczyń typu H w indukowanej błonie u pacjentów z krytycznym ubytkiem kości

Technika masquelet, zwana także indukowaną techniką membranową (IMT), została po raz pierwszy wprowadzona do leczenia ubytków kostnych o krytycznym rozmiarze do 25 cm w 1986 roku przez Pr. Alaina Charlesa Masqueleta i in. IMT jest dwuetapową operacją chirurgiczną, która w ostatnim czasie stanowi bardziej popularną opcję leczenia ubytków kostnych o rozmiarach krytycznych oraz braku zrostu złamania. Zasadniczo pierwszy etap IMT polega na wszczepieniu w miejsce ubytku cementu dystansowego z polimetakrylanu metylu (PMMA) obciążonego antybiotykami. W ciągu 6 do 8 tygodni ta przekładka indukuje tworzenie i dojrzewanie cienkiej warstwy zwanej indukowaną błoną otaczającą ją poprzez odpowiedź immunologiczną na ciało obce. W etapie II, spacer jest ostrożnie usuwany, utrzymując indukowaną błonę w miejscu złamania, a następnie wykonywany jest autologiczny przeszczep kości w celu wywołania gojenia kości. IMT zapewnia kilka korzystnych efektów, w tym stosunkowo proste zarządzanie w porównaniu z unaczynionymi przeszczepami strzałkowymi i brak znaczącej różnicy w czasie gojenia między różnymi rozmiarami ubytków. Warto zauważyć, że liczne operacje i długi czas rekonwalescencji to trudności, które wciąż trzeba pokonać u pacjentów leczonych IMT. Biorąc pod uwagę fakt, że indukowana membrana została uznana za niezbędny element udanego zrostu, jej bardziej szczegółowa i wszechstronna analiza poprawi proces IMT w celu złagodzenia tych trudności.

Projekt badania klinicznego będzie zgodny z opisem zawartym w Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board, które rozpocznie się w pierwszym roku, aż do osiągnięcia 15 pacjentów w każdej grupie. W skrócie, pacjenci z otwartym złamaniem zostaną losowo podzieleni na dwie grupy, aby zredukować bios selekcji, obejmujące grupy przerywnikowe (z indukowaną membraną) i bez grup przerywnikowych (bez indukowanej membrany). W grupie bez przekładki (Brak operacji w etapie I) zostaną pobrane tkanki miękkie w pobliżu miejsc złamania o wielkości 1 cm2 do wykorzystania jako odpowiednia kontrola membrany indukowanej (1 cm2) z grupy z przekładką (etap I + II ) w punkcie czasowym etapu II IMT. Tkanki zostaną podzielone na trzy części do proteomiki, metabolomiki i skrawki parafinowane, przechowywane w temperaturze minus 80 stopni przed eksperymentami. Sekcja ta jest niezbędna w tym projekcie, aby scharakteryzować powstawanie naczyń typu H i zdolność gojenia się kości. W tym celu przeprowadzone zostaną badania immunohistochemiczne (IHC) lub immunofluorescencyjne (IF) w celu zmierzenia białek zidentyfikowanych na podstawie wyników proteomiki zarówno w tkankach miękkich, jak i błonie indukowanej. Scharakteryzowane markery obejmujące klaster różnicowania 31 (CD31) i endomucynę (Emcn) zostaną użyte do wykrywania naczyń typu H. Można również przeprowadzić metody kolorymetryczne, w tym trichromię Massona, błękit Alcian, czerwień alizarynową S, H&E i zieleń safraniny O-Fast, aby ujawnić histologiczne spostrzeżenia dotyczące indukowanej błony. W multi-omice tkanki zostaną wykorzystane do ujawnienia nowych celów, które następnie zostaną porównane z poziomami czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i osteokalcyny. Ponadto zostanie przeprowadzona metoda Western blotting i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w celu sprawdzenia dalszej regulacji zidentyfikowanych metabolitów.

Krew żylna (3 ml w vacutainers z heparyną) zostanie pobrana od obu grup na Oddziale Chirurgii Ortopedycznej Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Tajwan. Protokół oparto na doniesieniu identyfikującym VEGF jako potencjalny biomarker zrostu w IMT. Po pobraniu krew będzie odwirowywana (1000 obr./min, 10 min w temperaturze pokojowej) przez 30 minut i przechowywana w temperaturze minus 80 stopni do czasu analizy. Próbki krwi z punktu czasowego pobrania błony indukowanej są przygotowywane do analizy multiomicznej w celu identyfikacji markerów ogólnoustrojowych dla naczynia typu H lub błony indukowanej, a VEGF i osteokalcyna zostaną użyte jako wskaźniki surowicy dla masy kostnej. Próbki krwi ze wszystkich punktów czasowych zostaną wykorzystane do zidentyfikowania nowego biomarkera naczyń typu H i gojenia się kości. Jeśli chodzi o cele metabolitów, do weryfikacji ich we krwi zostaną zastosowane ukierunkowane metody metabolomiki. Punktami czasowymi pobierania próbek krwi w stadium I będą dzień operacji, następny dzień operacji oraz 1, 2 i 4 tygodnie po operacji. Jeśli chodzi o etap II, punktami czasowymi będą dzień operacji, następny dzień operacji oraz 1, 2, 12 i 14 tygodni po operacji.