O Papel da Formação de Vasos Tipo H na Membrana Induzida de Pacientes com Defeito Ósseo de Tamanho Crítico

A técnica de masquelet, também chamada de técnica de membrana induzida (IMT), foi introduzida pela primeira vez para tratar defeitos ósseos de tamanho crítico de até 25 cm em 1986 por Pr. Alain Charles Masquelet e cols. A IMT é uma operação cirúrgica em dois estágios que recentemente oferece uma opção mais popular para o tratamento de defeitos ósseos de tamanho crítico, bem como fraturas não consolidadas. Basicamente, a primeira etapa do IMT compreende a implantação de um espaçador de cimento de polimetilmetacrilato (PMMA) carregado com antibióticos no local do defeito. Durante 6 a 8 semanas, este espaçador induz a formação e maturação de uma fina camada chamada membrana induzida envolvendo-o por meio de uma resposta imune de corpo estranho. No estágio II, o espaçador é removido cuidadosamente mantendo a membrana induzida no local da fratura, então é feito enxerto ósseo autólogo para provocar a consolidação óssea. O IMT confere vários efeitos benéficos, incluindo o manejo relativamente simples versus enxertos fibulares vascularizados e nenhuma diferença significativa no tempo de cicatrização entre vários tamanhos de defeitos. Vale ressaltar que múltiplas cirurgias e longo tempo de recuperação são as dificuldades ainda a serem vencidas em pacientes tratados com IMT. Tendo em vista que a membrana induzida tem sido considerada um componente indispensável para o sucesso da união, uma análise mais detalhada e abrangente da mesma irá aprimorar o processo de IMT para amenizar essas dificuldades.

O desenho do estudo clínico seguirá o descrito no Conselho de Revisão Institucional da Fundação Médica Chang Gung, que será iniciado no primeiro ano até atingir 15 pacientes para cada grupo. Resumidamente, os pacientes com fratura exposta serão divididos aleatoriamente em dois grupos para reduzir o bios de seleção, compreendendo os grupos espaçador (com membrana induzida) e sem espaçador (sem membrana induzida). Em um grupo sem espaçador (Sem operação do estágio I), tecidos moles próximos aos locais de fratura com tamanho de 1 cm2 serão coletados para serem usados ​​como controle adequado da membrana induzida (1 cm2) do grupo espaçador (Estágio I + II ) no ponto temporal da fase II do IMT. Os tecidos serão dissecados em três partes para proteômica, metabolômica e seção parafinada, armazenados a menos 80 graus antes dos experimentos. A seção é imperativa neste projeto para caracterizar a formação de vasos do tipo H e a capacidade de cicatrização óssea. Para tanto, será realizada imuno-histoquímica (IHC) ou imunofluorescência (IF) para mensuração de proteínas identificadas a partir de resultados de proteômica tanto em tecidos moles quanto em membrana induzida. Os marcadores caracterizados compreendendo cluster de diferenciação 31 (CD31) e Endomucina (Emcn) serão utilizados para detectar vasos do tipo H. Métodos colorimétricos, incluindo tricrômico de Masson, azul Alcian, vermelho Alizarin S, H&E e verde Safranin O-Fast também podem ser realizados para revelar insights histológicos da membrana induzida. Na multi-ômica, tecidos serão usados ​​para desvendar novos alvos, que serão então comparados com os níveis de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e osteocalcina. Além disso, western blotting e reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) em tempo real serão realizados para validar a regulação a jusante dos metabólitos identificados.

O sangue venoso (3ml em vacutainers com heparina) será coletado de ambos os grupos no Departamento de Cirurgia Ortopédica do Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Taiwan. O protocolo foi baseado em um relatório identificando o VEGF como um potencial biomarcador da união em IMT. Após a coleta, o sangue será centrifugado (1000RPM, 10min em temperatura ambiente) por 30 minutos e armazenado a 80 graus negativos até a análise. Amostras de sangue do ponto de tempo de coleta de membrana induzida são preparadas para análise multi-ômica para identificar marcadores sistêmicos para vaso tipo H ou membrana induzida, e VEGF e osteocalcina serão usados ​​como indicadores séricos de massa óssea. Amostras de sangue de todos os pontos de tempo serão usadas para identificar um novo biomarcador para vasos do tipo H e cicatrização óssea. Quanto aos alvos de metabólitos, métodos direcionados de metabolômica serão empregados para verificá-los no sangue. Os pontos de tempo para coleta de amostras de sangue do estágio I serão o dia da cirurgia, o dia seguinte da cirurgia e 1, 2 e 4 semanas após a cirurgia. Quanto ao estágio II, os pontos de tempo serão o dia da cirurgia, o dia seguinte da cirurgia e 1, 2, 12 e 14 semanas após a cirurgia.