Methylační profilování DNA v celém epigenomu v aneurysmálním subarachnoidálním krvácení a zpožděné ischemické neurologické deficit

Jedná se o prospektivní observační asociační studii s asociací epigenomu v oblasti případu (EWAS), která má zkoumat změny methylace DNA v periferní krvi pacientů s aneurysmálním subarachnoidálním krvácením (ASAH) a jejich potenciální asociaci se zpožděným ischemickým neurologickým deficitem (Dind). Cílem studie je identifikovat epigenetické biomarkery, které mohou přispět k patofyziologii ASAH a Dind, a také posoudit, zda tyto methylační vzorce mohou sloužit jako prediktivní markery pro progresi onemocnění.

Návrh a postupy studie

Populace:

• Pacienti s diagnózou ASAH budou prospektivně přijaty z terciárního neurochirurgického centra.
• Prospektivně přijatí pacienti budou anonymizováni a klasifikováni do skupin Dind a bez vlivu na základě klinických a radiologických kritérií.
• Subjekty zdravé kontroly budou porovnány podle věku, pohlaví, rasy a etnicity pomocí veřejně dostupného datového souboru (GSE246337).

Sběr a zpracování dat:

• Periferní vzorky plné krve (10 ml) budou odebrány do dnů 1-4 po hemoragii před nástupem vazospasmu.
• DNA bude extrahována pomocí metody solení, následovanou bisulfitovou konverzí pro profilování methylace.
• Analýza methylace DNA v celé genomu bude provedena pomocí mikročipu Infinium MethylationEpic V2.0, pokrývající ~ 850k CPG místa.
• Genotypizace bude prováděna pomocí globálního screeningového pole Illumina (GSA-24) V3.0 sestávající z více než 654 000 jedinečných lokusů. Software Plink V1.9 bude použit pro filtrování variant a statistické analýzy. V této analýze uvažujeme pouze o bi-elitických SNP na autosomech. Pokud tato analýza poskytne významné souvislosti mezi SNP a Dind, budou analyzovány methylační kvantitativní rysy lokusy na zkoumání interakcí s dlouhým dosahem mezi relevantními SNP a odlišně methylovanými místy CPG. Tyto interakce SNP-methylace by mohly poskytnout jedinečná a nová data o mechanismu vazospasmu.

• Zpracování dat bude prováděno pomocí balíčku SESAME R s přísnými opatřeními pro kontrolu kvality, včetně:

  • Odstranění sond překlenujících SNP s menší frekvencí alel> 1%.
  • Filtrování sond s nízkým počtem kuliček nebo detekce p-hodnot.
  • Vyloučení sond spojených s pohlavním chromozomem a nesprávně mapovaných sond.

Diagnóza Dind:

• Dind bude klinicky definován jako nový fokální neurologický deficit nebo glasgowský stupnice koma (GCS) pokles o ≥ 2 body, trvající> 1 hodinu a nelze přičíst jiným příčinám, jako je hydrocefalus, hyponatrémie nebo opětovné opětovné.
• Radiologické potvrzení vazospasmu bude založeno na mozkové angiografii, CT angiografii (CTA) nebo transkraniálním Dopplerovi (TCD).

Plán statistické analýzy

Odlišně methylované sondy (DMP):

• Identifikace DMP bude prováděna pomocí lineárních regresních modelů, přičemž Benjamini-Hochbergová korekce pro vícenásobná srovnání.
• Pouze místa CPG s absolutní β-hodnotou> 5% a upravená hodnota p <0,05 budou považována za významné.
• Epigenetické hodiny (Horvath Clock, Hannum Clock, Skinblood Clock, Fenoaage Clock, Grimage Clock) budou odhadnout biologický věk založený na methylačních vzorcích DNA na specifických místech CPG

Analýza strojového učení:

• Lasso regrese bude použita pro výběr prvků k identifikaci methylačních vzorců nejvíce prediktivní pro ASAH vs. zdravé kontroly a Dind vs. non-dist.
• Výkon prediktivních modelů bude hodnocen pomocí metriky R².

Analýza funkčního obohacení:

• Analýza obohacení genu (GSEA) za použití funkce „Gene2func“ funkční mapování a anotace platformy pro asociaci genomu (FUMA GWAS) a genomických oblastí obohacení anotací (velké) se použije k identifikaci biologických cest spojených s významnými změnami methylace.
• Analýza cest se zaměří na imunitní odpověď, neuroinflamaci, endoteliální dysfunkci a metabolismus fosforu, protože tyto procesy byly zapojeny do patofyziologie ASAH.

Zajištění kvality a ověření dat

Interní ověření dat:

• Automatizované kontroly dat budou použity k identifikaci nesrovnalostí v methylačních profilech.
• Srovnávací analýza proti referenčním datovým souborům zajistí, že se methylační vzorce v souladu se známými biologickými mechanismy.

Ověření zdrojových dat:

• Methylační profily budou křížově kontrolovány veřejně dostupnými databázemi, aby byla zajištěna konzistence s předchozími asociačními studiemi pro celé epigenom.
• Demografické a klinické údaje pacienta budou ověřeny proti elektronickým lékařským záznamům, aby byla zajištěna přesnost.

Zpracování chybějících dat:

• Pokud údaje o methylaci pro konkrétní místa CPG chybí nebo pod detekční prahové hodnoty, budou tyto stránky vyloučeny z analýzy.
• Chybějící klinické údaje budou zpracovávány pomocí více metod imputace k minimalizaci zkreslení.

Odůvodnění velikosti vzorku

Kohortová složení:

• 61 pacientů s ASAH (32 s Dind, 29 bez Dindu).
• 61 odpovídalo zdravým ovládacím prvkům z GSE246337.

Relativně malá velikost vzorku byla vybrána na základě předchozích studií EWAS v omezeních ASAH a budoucích směrech

Omezení specifická pro tkáň:

o Studie používá periferní krevní DNA, která nemusí plně odrážet methylační změny v mozkové vaskulatuře. Budoucí studie by měly ověřit nálezy v arteriální stěně postižené cévy pomocí modelů potkanů ​​s nízkou mortitou nebo mozkomíšního moku.

Omezení podskupiny podskupiny:

o Vzhledem k relativně malé velikosti vzorku budou zjištění související s Dindem vyžadovat externí ověření ve větších kohortách.

Závěr Tato studie si klade za cíl poskytnout nové poznatky o epigenetických změnách spojených s ASAH a Dind. Identifikací odlišně methylovaných míst CPG se studie snaží zlepšit objev biomarkerů pro včasnou stratifikaci rizika a potenciální terapeutické cíle u pacientů s ASAH.