Perfil de metilación de ADN en todo el epigenoma en hemorragia subaracnoidea aneurismal y déficit neurológico isquémico retrasado

Este es un estudio de asociación de epigenoma de casos observacional prospectivo (EWAS) diseñado para investigar los cambios de metilación del ADN en la sangre periférica de pacientes con hemorragia subaracnoidea aneurismal (ASAH) y su posible asociación con déficit neurológico isquémico tardío (DIND). El estudio tiene como objetivo identificar biomarcadores epigenéticos que puedan contribuir a la fisiopatología de Asah y Dind, así como a evaluar si estos patrones de metilación pueden servir como marcadores predictivos para la progresión de la enfermedad.

Diseño y procedimientos de estudio

Población:

• Los pacientes diagnosticados con ASAH serán reclutados prospectivamente de un centro neurociruúrgico terciario.
• Los pacientes reclutados prospectivamente se anonimizarán y clasificarán en grupos DIND y no certificadores basados ​​en criterios clínicos y radiológicos.
• Los sujetos de control saludable se igualarán por edad, sexo, raza y etnia utilizando un conjunto de datos disponible en público (GSE246333).

Recopilación y procesamiento de datos:

• Las muestras de sangre completa periférica (10 ml) se recolectarán en los días 1-4 después de la hemorragia antes del inicio del vasoespasmo.
• El ADN se extraerá utilizando el método de salto, seguido de la conversión de bisulfito para el perfil de metilación.
• El análisis de metilación de ADN de todo el genoma se realizará utilizando el microarray de infinio metilationepic v2.0 Beadchip, que cubre ~ 850k sitios CpG.
• El genotipado se realizará utilizando la matriz de detección global de Illumina (GSA-24) v3.0 que consiste en más de 654 000 loci únicos. El software PLINK V1.9 se utilizará para el filtrado de variantes y los análisis estadísticos. Consideramos en este análisis solo SNP bialélicos en autosomas. Si este análisis produce asociaciones significativas entre los SNP y Dind, los loci de rasgos cuantitativos de metilación se analizarán para el examen de las interacciones de largo alcance entre los SNP relevantes y los sitios CPG metilados diferencialmente. Estas interacciones de metilación de SNP podrían proporcionar datos únicos y novedosos sobre el mecanismo de vasoespasmo.

• El procesamiento de datos se realizará utilizando el paquete sesame R con rigurosas medidas de control de calidad, que incluyen:

  • Eliminación de sondas que abarcan SNP con una frecuencia de alelo menor> 1%.
  • Filtrando sondas con bajos valores P de cuentas o detección.
  • Exclusión de sondas asociadas a cromosomas sexuales y sondas mapeadas incorrectamente.

Diagnóstico de Dind:

• Dind se definirá clínicamente como un nuevo déficit neurológico focal o la disminución de la escala de coma de Glasgow (GCS) de ≥2 puntos, duradera> 1 hora y no atribuible a otras causas como hidrocefalia, hiponatremia o reflejado.
• La confirmación radiológica del vasoespasmo se basará en la angiografía cerebral, la angiografía por TC (CTA) o los hallazgos de Doppler transcraneal (TCD).

Plan de análisis estadístico

Sondas metiladas diferencialmente (DMP):

• La identificación de DMP se realizará utilizando modelos de regresión lineal, con la corrección de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples.
• Solo los sitios de CpG con un valor Δβ absoluto> 5% y un valor p ajustado <0.05 se considerarán significativos.
• Los relojes epigenéticos (reloj Horvath, reloj Hannum, reloj de sangre, reloj de fenoaje, reloj de mueca) estimarán la edad biológica en función de los patrones de metilación de ADN en sitios específicos de CPG

Análisis de aprendizaje automático:

• La regresión de lasso se aplicará para la selección de características para identificar los patrones de metilación más predictivos de los controles ASAH frente a los controles sanos y Dind frente a la no dind.
• El rendimiento de los modelos predictivos se evaluará utilizando la métrica R².

Análisis de enriquecimiento funcional:

• Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) utilizando la función "Gene2Func" del mapeo funcional y la anotación de la plataforma de estudios de asociación de genoma (FUMA GWAS) y el enriquecimiento de las regiones genómicas de la herramienta de anotaciones (GRAN) para identificar vías biológicas asociadas con cambios significativos de metilación.
• El análisis de la vía se centrará en la respuesta inmune, la neuroinflamación, la disfunción endotelial y el metabolismo de fosforo, ya que estos procesos se han implicado en la fisiopatología de Asah.

Garantía de calidad y validación de datos

Validación de datos internos:

• Las verificaciones de datos automatizadas se utilizarán para identificar inconsistencias en los perfiles de metilación.
• El análisis comparativo contra los conjuntos de datos de referencia garantizará que los patrones de metilación se alineen con mecanismos biológicos conocidos.

Verificación de datos de origen:

• Los perfiles de metilación se verificarán cruzados con bases de datos disponibles públicamente para garantizar la coherencia con los estudios previos de asociación en todo el epigenoma.
• Los datos demográficos y clínicos del paciente se verificarán contra los registros médicos electrónicos para garantizar la precisión.

Manejo de datos faltantes:

• Si faltan datos de metilación para sitios CPG específicos o por debajo de los umbrales de detección, estos sitios serán excluidos del análisis.
• Los datos clínicos faltantes se manejarán utilizando múltiples métodos de imputación para minimizar el sesgo.

Justificación del tamaño de la muestra

Composición de cohorte:

• 61 pacientes con ASAH (32 con Dind, 29 sin Dind).
• 61 controles sanos emparejados de GSE246337.

El tamaño de muestra relativamente pequeño se eligió en base a estudios de EWAS anteriores en limitaciones de Asah y direcciones futuras

Limitaciones específicas del tejido:

o El estudio utiliza el ADN sanguíneo periférico, lo que puede no reflejar completamente los cambios de metilación en la vasculatura cerebral. Los estudios futuros deberían validar los hallazgos en la pared arterial del vaso afectado utilizando modelos de rata de baja mortalidad o líquido cefalorraquídeo.

Dind Limitaciones del subgrupo:

o Debido al tamaño de la muestra relativamente pequeño, los hallazgos relacionados con Dind requerirán validación externa en cohortes más grandes.

Conclusión Este estudio tiene como objetivo proporcionar nuevas ideas sobre los cambios epigenéticos asociados con Asah y Dind. Al identificar sitios de CPG metilados diferencialmente, el estudio busca mejorar el descubrimiento de biomarcadores para la estratificación del riesgo temprano y posibles objetivos terapéuticos en pacientes con ASAH.