Профилирование метилирования ДНК в эпигеноме в аневризмальном субарахноидальном кровоизлиянии и задержку ишемического неврологического дефицита

Это проспективное исследование ассоциации эпигенома в общении наблюдателя, предназначенное для изучения изменений метилирования ДНК в периферической крови пациентов с аневризмальным субарахноидальным кровоизлиянием (ASAH) и их потенциальной связи с отсроченным ишемическим неврологическим дефицитом (DIND). Исследование направлено на выявление эпигенетических биомаркеров, которые могут способствовать патофизиологии ASAH и DIND, а также для оценки того, могут ли эти паттерны метилирования служить прогнозными маркерами для прогрессирования заболевания.

Проектирование и процедуры изучения

Население:

• Пациенты с диагнозом аса будут проспективно набираются из третичного нейрохирургического центра.
• Перспективно набираемые пациенты будут анонимизированы и классифицированы на группы DIND и не дисвязки на основе клинических и радиологических критериев.
• Здоровые контрольные субъекты будут соответствовать возрасту, полу, расе и этнической принадлежности с использованием общедоступного набора данных (GSE246337).

Сбор и обработка данных:

• Периферические образцы цельной крови (10 мл) будут собраны в течение 1-4 после получения обезживания до начала вазоспазма.
• ДНК будет извлечена с использованием метода засорения, за которым следует преобразование бисульфита для профилирования метилирования.
• Анализ метилирования ДНК в масштабах генома будет проходить с использованием микрочипа метилирования инфиния V2.0, покрывающих сайты ~ 850K CPG.
• Генотипирование будет выполняться с использованием Global Screening Array (GSA-24) v3.0 Illumina, состоящей из более чем 654 000 уникальных локусов. Программное обеспечение Plink v1.9 будет использоваться для фильтрации варианта и статистического анализа. В этом анализе мы рассматриваем только биоаллельные SNP на аутосомах. Если этот анализ дает значительные связи между SNP и DIND, локусы количественных признаков метилирования будут проанализированы для изучения дальних взаимодействий между соответствующими SNP и дифференциально метилированными сайтами CPG. Эти взаимодействия SNP-метилирования могут предоставить уникальные и новые данные о механизме вазоспазма.

• Обработка данных будет выполняться с использованием пакета Sesame R с строгими мерами контроля качества, включая:

  • Удаление зондов, охватывающих SNP с небольшой частотой аллелей> 1%.
  • Фильтрация зондов с низким количеством гранул или обнаружением p-значений.
  • Исключение связанных с половыми хромосомами зондов и неправильно отображенных зондов.

Диагноз DIND:

• DIND будет клинически определен как новый фокальный неврологический дефицит или снижение шкалы комы Глазго (GCS) на ≥2 точек, продолжительностью> 1 час и не связано с другими причинами, такими как гидроцефалия, гипонатриемия или повторное перепечение.
• Рентгенологическое подтверждение вазоспазма будет основано на церебральной ангиографии, общеобразовательной ангиографии (CTA) или транскраниальных доплеровских данных (TCD).

Статистический план анализа

Дифференциально метилированные зонды (DMP):

• Идентификация DMP будет проводиться с использованием моделей линейной регрессии с коррекцией Бенджамина-Хохберга для множественных сравнений.
• Только сайты CPG с абсолютным Δβ-значением> 5% и скорректированным значением P <0,05 будут считаться значимыми.
• Эпигенетические часы (часы Horvath, часы Hannum, часы для крови, феноарные часы, часы мрачного) будут оценить биологический возраст на основе паттернов метилирования ДНК на определенных сайтах CPG

Анализ машинного обучения:

• Регрессия Lasso будет применена для выбора признаков для определения паттернов метилирования, наиболее прогнозирующих ASAH и здоровых контролей и DIND против DIND-DIND.
• Производительность прогнозирующих моделей будет оцениваться с использованием метрики R².

Функциональный анализ обогащения:

• Анализ обогащения генов (GSEA) с использованием функции «Gene2func» функционального картирования и аннотации платформы исследований в области ассоциаций по всему геному (FUMA GWAS) и обогащение геномных областей инструмента аннотаций (GRAL) будет использоваться для идентификации биологических путей, связанных со значительными изменениями метилирования.
• Анализ пути будет сосредоточен на иммунном ответе, нейровоспалении, эндотелиальной дисфункции и метаболизме фосфора, поскольку эти процессы были вовлечены в патофизиологию Asah.

Обеспечение качества и проверка данных

Внутренняя проверка данных:

• Автоматизированные проверки данных будут использоваться для выявления несоответствий в профилях метилирования.
• Сравнительный анализ против эталонных наборов данных гарантирует, что паттерны метилирования совпадают с известными биологическими механизмами.

Проверка исходных данных:

• Профили метилирования будут перепроверлены с общедоступными базами данных, чтобы обеспечить согласованность с предыдущими исследованиями ассоциации в широком эпигеноме.
• Демографические и клинические данные пациента будут проверены на электронных медицинских картах для обеспечения точности.

Обработка недостающих данных:

• Если данные метилирования для конкретных сайтов CPG отсутствуют или ниже пороговых значений обнаружения, эти сайты будут исключены из анализа.
• Пропущенные клинические данные будут обрабатываться с использованием множественных методов вменения, чтобы минимизировать смещение.

Обоснование размера выборки

Когортная композиция:

• 61 пациенты с АСАХ (32 с Диндом, 29 без Динда).
• 61 Сопоставленные здоровые контроли от GSE246337.

Относительно небольшой размер выборки был выбран на основе предыдущих исследований EWAS в ограничениях ASAH и будущих направлениях

Тканевые ограничения:

o В исследовании используется ДНК периферической крови, которая может не полностью отражать изменения метилирования в сосудистой сети головного мозга. Будущие исследования должны подтвердить результаты в артериальной стенке пораженного сосуда с использованием моделей крыс с низкой морякой или спинномозговой жидкости.

Ограничения подгруппы DIND:

o Из -за относительно небольшого размера выборки результаты, связанные с DIND, потребуют внешней проверки в более крупных когортах.

Заключение Это исследование направлено на то, чтобы дать новое понимание эпигенетических изменений, связанных с Аса и Диндом. Идентифицируя дифференциально метилированные сайты CPG, исследование направлено на улучшение открытия биомаркера для ранней стратификации риска и потенциальных терапевтических мишеней у пациентов с ASAH.