Profilowanie metylacji DNA obejmujące całe epigenom w tętniaku krwotok podpajęczynówkowy i opóźniony niedokrwienny deficyt neurologiczny

Jest to prospektywne obserwacyjne badanie asocjacyjne epigenomu kontrolnego przypadków (EWAS) zaprojektowane w celu zbadania zmian metylacji DNA we krwi obwodowej pacjentów z tętniakiem krwotokiem podpajęczynówkowym (ASAH) i ich potencjalnym powiązaniem z opóźnionym niedokrwałym deficytem neurologicznym (DIND). Badanie ma na celu zidentyfikowanie epigenetycznych biomarkerów, które mogą przyczynić się do patofizjologii ASAH i DIND, a także ocena, czy te wzorce metylacji mogą służyć jako markery predykcyjne do postępu choroby.

Projekt i procedury badania

Populacja:

• Pacjenci zdiagnozowane ASAH zostaną prospektywnie rekrutowani z trzeciego centrum neurochirurgicznego.
• Pacjenci prospektywnie rekrutowani zostaną anonimizowani i sklasyfikowani w grupach DIND i nie-DIND na podstawie kryteriów klinicznych i radiologicznych.
• Osobnicy zdrowej kontroli będą dopasowani do wieku, płci, rasy i pochodzenia etnicznego przy użyciu publicznie dostępnego zestawu danych (GSE246337).

Zbieranie i przetwarzanie danych:

• Próbki pełnej krwi obwodowej (10 ml) zostaną zebrane w ciągu dnia 1-4 po hemorrhage przed wystąpieniem skurczu naczyń.
• DNA zostanie wyekstrahowane metodą solania, a następnie konwersję bisulfitu do profilowania metylacji.
• Analiza metylacji DNA całego genomu zostanie przeprowadzona przy użyciu mikromacierza Beadchip V2.0 Infinium metylacyjna V2.0, obejmująca ~ 850 000 miejsc CpG.
• Genotypowanie zostanie wykonywane przy użyciu Global Screening Maciera Illumina (GSA-24) V3.0 składającego się z ponad 654 000 unikalnych loci. Oprogramowanie PLINK V1.9 będzie używane do filtrowania wariantu i analiz statystycznych. Rozważamy w tej analizie tylko bi-równoległe SNP na autosomach. Jeśli ta analiza daje znaczące powiązania między SNP i DIND, loci cechy ilościowej metylacji zostaną przeanalizowane w celu zbadania interakcji dalekiego zasięgu między odpowiednimi SNP i różnicowo metylowanymi miejscami CPG. Te interakcje-metylacja SNP mogą dostarczyć unikalnych i nowatorskich danych na temat mechanizmu wazospazmu.

• Przetwarzanie danych zostanie przeprowadzone przy użyciu pakietu Sesame R z rygorystycznymi miarami kontroli jakości, w tym:

  • Usunięcie sond obejmujących SNP z niewielką częstotliwością alleli> 1%.
  • Odfiltrowanie sond o niskiej liczbie koralików lub wartości p detekcji.
  • Wykluczenie sond związanych z chromosomem płciowym i nieprawidłowo zmapowanych sond.

Diagnoza Dind:

• DInd zostanie klinicznie zdefiniowany jako nowy ogniskowy deficyt neurologiczny lub spadek Glasgow COMA Skala (GCS) o ≥2 punkty, trwającą> 1 godzinę i nie można przypisać innym przyczynom, takim jak wodogłowie, hiponatremia lub powrót.
• Radiologiczne potwierdzenie skurczu naczyń będzie oparte na angiografii mózgowej, angiografii CT (CTA) lub przezczółkowym dopplerze (TCD).

Plan analizy statystycznej

Różnicowo metylowane sondy (DMP):

• Identyfikacja DMP będzie przeprowadzana przy użyciu modeli regresji liniowej, z korekcją Benjamini-Hochberga dla wielu porównań.
• Tylko miejsca CPG z bezwzględną wartością Δβ> 5% i skorygowaną wartość p <0,05 zostaną uznane za znaczące.
• Zegary epigenetyczne (zegar Horvath, zegar Hannum, zegar płyny skóry, zegar fenazowy, zegar grymage) oszacują wiek biologiczny na podstawie wzorów metylacji DNA w określonych miejscach CpG

Analiza uczenia maszynowego:

• Regresja Lasso zostanie zastosowana do selekcji cech w celu zidentyfikowania wzorców metylacji najbardziej predykcyjnych dla ASAH vs. zdrowych kontroli i DIND vs. nie-dind.
• Wydajność modeli predykcyjnych zostanie oceniona za pomocą metryki R².

Analiza funkcjonalnego wzbogacania:

• Analiza wzbogacania zestawu genów (GSEA) przy użyciu funkcji funkcjonalnego mapowania funkcjonalnego i adnotacji platformy asocjacyjnej (FUMA GWAS) i genomowych narzędzie do adnotacji (Great) zostanie zastosowane do identyfikacji szlaków biologicznych związanych z znaczącymi zmianami metylacji.
• Analiza szlaku koncentruje się na odpowiedzi immunologicznej, zapłaty neuroinowej, dysfunkcji śródbłonka i metabolizmie fosforu, ponieważ procesy te są zaangażowane w patofizjologię ASAH.

Zapewnienie jakości i walidacja danych

Wewnętrzne sprawdzanie danych:

• Zautomatyzowane kontrole danych zostaną wykorzystane do identyfikacji niespójności w profilach metylacji.
• Analiza porównawcza w stosunku do referencyjnych zestawów danych zapewni, że wzorce metylacji są zgodne z znanymi mechanizmami biologicznymi.

Weryfikacja danych źródłowych:

• Profile metylacji zostaną sprawdzone krzyżowo z publicznie dostępnymi bazami danych, aby zapewnić spójność z poprzednimi badaniami asocjacyjnymi obejmującymi cały epigenom.
• Dane demograficzne i kliniczne pacjentów zostaną zweryfikowane w stosunku do elektronicznej dokumentacji medycznej w celu zapewnienia dokładności.

Obsługa brakujących danych:

• Jeśli brakuje danych metylacji dla określonych miejsc CPG lub poniżej progów wykrywania, strony te zostaną wykluczone z analizy.
• Brakuje danych klinicznych za pomocą wielu metod imputacji w celu zminimalizowania stronniczości.

Uzasadnienie wielkości próbki

Kompozycja kohortowa:

• 61 pacjentów z ASAH (32 z Dind, 29 bez Dind).
• 61 Dopasowane zdrowe kontrole z GSE246337.

Stosunkowo niewielką wielkość próby wybrano na podstawie wcześniejszych badań EWAS w ograniczeniach ASAH i przyszłych kierunkach

Ograniczenia specyficzne dla tkanek:

o Badanie wykorzystuje obwodowe DNA krwi, które może nie w pełni odzwierciedlać zmiany metylacji w naczyniu mózgowym. Przyszłe badania powinny potwierdzić wyniki ściany tętniczej dotkniętego naczynia przy użyciu modeli szczurów o niskiej przepustowości lub płynu mózgowo-rdzeniowego.

Ograniczenia podgrupy Dind:

o Ze względu na stosunkowo niewielką wielkość próbki wyniki związane z DIND będą wymagały zewnętrznej walidacji w większych kohortach.

Wniosek To badanie ma na celu zapewnienie nowych wglądu w zmiany epigenetyczne związane z ASAH i DIND. Zidentyfikując różnicowo metylowane miejsca CPG, badanie ma na celu poprawę odkrycia biomarkerów w celu wczesnego rozwarstwienia ryzyka i potencjalnych celów terapeutycznych u pacjentów z ASAH.