Epigenom-bred DNA-metyleringsprofilering i aneurysmal subarachnoid blødning og forsinket iskemisk nevrologisk underskudd

Dette er et prospektivt observasjonell case-control epigenom-bred assosiasjonsstudie (EWAS) designet for å undersøke DNA-metyleringsendringer i perifert blod hos pasienter med aneurysmal subarachnoid blødning (ASAH) og deres potensielle assosiasjon med forsinket iskemisk nevrologisk underskudd (DIND). Studien tar sikte på å identifisere epigenetiske biomarkører som kan bidra til patofysiologien til ASAH og DIND, samt å vurdere om disse metyleringsmønstrene kan tjene som prediktive markører for sykdomsprogresjon.

Studiedesign og prosedyrer

Befolkning:

• Pasienter diagnostisert med ASAH vil bli rekruttert prospektivt fra et tertiært nevrokirurgisk senter.
• De prospektivt rekrutterte pasientene vil bli anonymisert og klassifisert i DIND- og ikke-DIND-grupper basert på kliniske og radiologiske kriterier.
• Sunne kontrollpersoner vil bli matchet for alder, kjønn, rase og etnisitet ved hjelp av et offentlig tilgjengelig datasett (GSE246337).

Datainnsamling og prosessering:

• Perifere helblodprøver (10 ml) vil bli samlet i løpet av dagene 1-4 etter hemorrhage før begynnelsen av vasospasme.
• DNA vil bli ekstrahert ved bruk av saltingsmetoden, etterfulgt av bisulfittomdannelse for metyleringsprofilering.
• Genom-bred DNA-metyleringsanalyse vil bli utført ved bruk av Infinium MethyLationepic V2.0 BeadChip Microarray, som dekker ~ 850k CpG-steder.
• Genotyping vil bli utført ved hjelp av Illumina Global Screening Array (GSA-24) v3.0 bestående av over 654 000 unike loci. PLink V1.9 -programvare vil bli brukt til variantfiltrering og statistiske analyser. Vi vurderer i denne analysen bare bi-alleliske SNP-er på autosomer. Hvis denne analysen gir signifikante assosiasjoner mellom SNP og DIND, vil metyleringskvantitative trekkloki analyseres for undersøkelse av langdistanseinteraksjoner mellom relevante SNP-er og differensialt metylert CpG-steder. Disse SNP-metyleringsinteraksjonene kan gi unike og nye data om vasospasmemekanismen.

• Databehandling vil bli utført ved hjelp av Sesame R -pakke med strenge kvalitetskontrolltiltak, inkludert:

  • Fjerning av sonder som spenner over SNP -er med en mindre allelfrekvens> 1%.
  • Filtrering av sonder med lav perleantall eller deteksjon p-verdier.
  • Ekskludering av kjønnskromosomassosierte sonder og feil kartlagte sonder.

Diagnostisering av DIND:

• DIND vil være klinisk definert som et nytt fokal nevrologisk underskudd eller Glasgow COMA -skala (GCS) nedgang på ≥2 poeng, som varer> 1 time og ikke kan tilskrives andre årsaker som hydrocephalus, hyponatremia eller gjenblødning.
• Radiologisk bekreftelse av vasospasme vil være basert på cerebral angiografi, CT -angiografi (CTA) eller transkranial Doppler (TCD) funn.

Statistisk analyseplan

Differensielt metylerte sonder (DMP):

• Identifisering av DMP-er vil bli utført ved bruk av lineære regresjonsmodeller, med Benjamini-Hochberg-korreksjon for flere sammenligninger.
• Bare CpG-steder med en absolutt Δβ-verdi> 5% og en justert p-verdi <0,05 vil bli ansett som signifikant.
• Epigenetiske klokker (Horvath Clock, Hannum Clock, Skinblood Clock, Phenoage Clock, Grimage Clock) vil estimere biologisk alder basert på DNA -metyleringsmønstre på spesifikke CpG -steder

Maskinlæringsanalyse:

• Lasso-regresjon vil bli brukt for funksjonsvalg for å identifisere metyleringsmønstre som er mest prediktive for ASAH vs. sunne kontroller og DIND kontra ikke-DIND.
• Ytelsen til de prediktive modellene vil bli vurdert ved bruk av R² -metrikken.

Funksjonell berikelsesanalyse:

• Gensettanrikningsanalyse (GSEA) ved bruk av "Gene2Func" -funksjonen for funksjonell kartlegging og merknad av genomomfattende assosiasjonsstudierplattform (FUMA GWAS) og genomiske regioner berikelse av merknadsverktøy (Great) vil bli brukt til å identifisere biologiske veier assosiert med signifikante metyleringsendringer.
• Pathway -analyse vil fokusere på immunrespons, neuroinflammasjon, endotelial dysfunksjon og fosfor metabolisme, ettersom disse prosessene har blitt implisert i ASAH -patofysiologi.

Kvalitetssikring og datavalidering

Intern datavalidering:

• Automatiserte datakontroller vil bli brukt til å identifisere uoverensstemmelser i metyleringsprofiler.
• Sammenlignende analyse mot referansedatasett vil sikre at metyleringsmønstre stemmer overens med kjente biologiske mekanismer.

Kildedataverifisering:

• Metyleringsprofiler vil bli krysssjekket med offentlig tilgjengelige databaser for å sikre konsistens med tidligere epigenomomfattende assosiasjonsstudier.
• Pasientdemografiske og kliniske data vil bli bekreftet mot elektroniske medisinske poster for å sikre nøyaktighet.

Håndtering av manglende data:

• Hvis metyleringsdata for spesifikke CpG -nettsteder mangler eller under deteksjonsgrenser, vil disse nettstedene bli ekskludert fra analyse.
• Manglende kliniske data vil bli håndtert ved hjelp av flere imputasjonsmetoder for å minimere skjevhet.

Prøvestørrelse begrunnelse

Kohortsammensetning:

• 61 ASAH -pasienter (32 med DIND, 29 uten DIND).
• 61 matchet sunne kontroller fra GSE246337.

Den relativt lille prøvestørrelsen ble valgt basert på tidligere EWAS -studier i ASAH -begrensninger og fremtidige retninger

Vevsspesifikke begrensninger:

o Studien bruker perifert blod -DNA, som kanskje ikke helt gjenspeiler metyleringsendringer i cerebral vaskulatur. Fremtidige studier bør validere funn i arterieveggen til det berørte karet ved bruk av rotte modeller eller cerebrospinalvæske.

DIND -undergruppebegrensninger:

o På grunn av den relativt små prøvestørrelsen, vil funn relatert til DIND kreve ekstern validering i større årskull.

Konklusjon Denne studien tar sikte på å gi ny innsikt i epigenetiske endringer assosiert med ASAH og DIND. Ved å identifisere differensiert metylert CpG -steder, søker studien å forbedre biomarkøroppdagelsen for tidlig risikostratifisering og potensielle terapeutiske mål hos ASAH -pasienter.