Perfil de metilação do DNA em todo o epigenoma em hemorragia subaracnóidea aneurismática e déficit neurológico isquêmico retardado

Este é um estudo prospectivo de associação em todo o caso de caso de caso de caso de caso (EWAS), projetado para investigar alterações de metilação do DNA no sangue periférico de pacientes com hemorragia subaracnóidea aneurismática (ASAH) e sua potencial associação com déficit neurológico isquêmico retardado (Dind). O estudo tem como objetivo identificar biomarcadores epigenéticos que podem contribuir para a fisiopatologia da ASAH e da DIND, bem como para avaliar se esses padrões de metilação podem servir como marcadores preditivos para a progressão da doença.

Desenho e procedimentos do estudo

População:

• Os pacientes diagnosticados com ASAH serão prospectivamente recrutados de um centro neurocirúrgico terciário.
• Os pacientes prospectivamente recrutados serão anonimizados e classificados em grupos DIND e não-encontros com base em critérios clínicos e radiológicos.
• Os sujeitos de controle saudável serão comparados a idade, sexo, raça e etnia usando um conjunto de dados disponível ao público (GSE246337).

Coleta e processamento de dados:

• Amostras de sangue total periférico (10 mL) serão coletadas em dias 1-4 após a hemorragia antes do início do vasoespasmo.
• O DNA será extraído usando o método de salga, seguido pela conversão de bissulfito para o perfil de metilação.
• A análise de metilação do DNA em todo o genoma será realizada usando o microarray infinium metilationepic v2.0 BeadChip, cobrindo ~ 850K de locais CPG.
• A genotipagem será realizada usando a matriz de triagem global Illumina (GSA-24) v3.0, composta por mais de 654 000 loci exclusivos. O software PLINK V1.9 será usado para as análises de filtragem e estatística variantes. Consideramos nesta análise apenas SNPs bi-alélicos em autossomos. Se essa análise produzir associações significativas entre SNPs e DIND, os locos de características quantitativas de metilação serão analisadas para exame de interações de longo alcance entre SNPs relevantes e locais de CPG diferencialmente metilados. Essas interações SNP-metilação podem fornecer dados exclusivos e novos sobre o mecanismo do vasoespasmo.

• O processamento de dados será realizado usando o pacote de gergelim R com rigorosas medidas de controle de qualidade, incluindo:

  • Remoção de sondas que abrangem SNPs com uma frequência de alelo menor> 1%.
  • Filtrando sondas com baixa contagem de contas de esferas ou valores de detecção.
  • Exclusão de sondas associadas ao cromossomo sexual e sondas mapeadas incorretamente.

Diagnóstico de Dind:

• O DIND será definido clinicamente como um novo declínio focal de déficit neurológico ou escala de coma de Glasgow (GCS) de ≥2 pontos, com duração> 1 hora e não atribuível a outras causas, como hidrocefalia, hiponatremia ou ressalto.
• A confirmação radiológica do vasoespasmo será baseada na angiografia cerebral, na angiografia por CT (CTA) ou achados de Doppler transcraniano (TCD).

Plano de Análise Estatística

Sondas diferencialmente metiladas (DMPs):

• A identificação de DMPs será realizada usando modelos de regressão linear, com correção de Benjamini-Hochberg para comparações múltiplas.
• Somente locais de CPG com valor Δβ absoluto> 5% e um valor p ajustado <0,05 serão considerados significativos.
• Relógios epigenéticos (relógio Horvath, relógio Hannum, relógio de sangue, relógio de fenoagem, relógio de careta) estimará a idade biológica com base nos padrões de metilação do DNA em sites específicos de CPG

Análise de aprendizado de máquina:

• A regressão do lasso será aplicada para a seleção de recursos para identificar padrões de metilação mais preditivos de Asaah vs. controles saudáveis ​​e DIND vs. não-decada.
• O desempenho dos modelos preditivos será avaliado usando a métrica R².

Análise de enriquecimento funcional:

• Análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA) usando a função "Gene2FUNC" do mapeamento funcional e anotação da plataforma de estudos de associação em todo o genoma (FUMA GWAS) e regiões genômicas que enriquecem a ferramenta de anotações (Great) serão usadas para identificar vias biológicas associadas a mudanças significativas de metilação.
• A análise das via se concentrará na resposta imune, neuroinflamação, disfunção endotelial e metabolismo fosforoso, pois esses processos foram implicados na fisiopatologia da ASAH.

Garantia de qualidade e validação de dados

Validação de dados internos:

• As verificações de dados automatizadas serão usadas para identificar inconsistências nos perfis de metilação.
• A análise comparativa dos conjuntos de dados de referência garantirá que os padrões de metilação alinhem com mecanismos biológicos conhecidos.

Verificação de dados de origem:

• Os perfis de metilação serão verificados com bancos de dados disponíveis ao público para garantir consistência com estudos anteriores de associação em todo o epigenoma.
• Os dados demográficos e clínicos do paciente serão verificados contra registros médicos eletrônicos para garantir a precisão.

Manuseio de dados ausentes:

• Se os dados de metilação para locais específicos de CPG estiverem ausentes ou abaixo dos limiares de detecção, esses locais serão excluídos da análise.
• Os dados clínicos ausentes serão tratados usando vários métodos de imputação para minimizar o viés.

Justificação do tamanho da amostra

Composição da coorte:

• 61 pacientes da ASAH (32 com Dind, 29 sem Dind).
• 61 MAIS COMPRONHAÇÕES MAIS COMPLEÍSTICAS DO GSE246337.

O tamanho da amostra relativamente pequeno foi escolhido com base em estudos de EWAs anteriores em limitações de Asah e direções futuras

Limitações específicas de tecido:

o O estudo utiliza o DNA do sangue periférico, que pode não refletir completamente as alterações de metilação na vasculatura cerebral. Estudos futuros devem validar achados na parede arterial do vaso afetado usando modelos de ratos de baixa mortalidade ou líquido cefalorraquidiano.

Dind Limitações de subgrupo:

o Devido ao tamanho da amostra relativamente pequeno, os achados relacionados ao DIND exigirão validação externa em coortes maiores.

Conclusão Este estudo tem como objetivo fornecer novas idéias sobre alterações epigenéticas associadas à ASAH e DIND. Ao identificar os locais de CPG diferencialmente metilados, o estudo busca melhorar a descoberta de biomarcadores para estratificação de risco precoce e potenciais alvos terapêuticos em pacientes com ASAH.