Profilazione della metilazione del DNA a livello di epigenoma nell'emorragia subaracnoide aneurismale e deficit neurologico ischemico ritardato

Si tratta di uno studio di associazione di epigenoma a livello di epigenoma (EWAS) di osservazione prospettica di osservazione per studiare i cambiamenti della metilazione del DNA nel sangue periferico dei pazienti con emorragia subaracnoidea aneurismale (ASAH) e la loro potenziale associazione con deficit neurologico ischemico ritardato (DIND). Lo studio mira a identificare biomarcatori epigenetici che possono contribuire alla fisiopatologia di Asah e Dind, nonché a valutare se questi modelli di metilazione possono servire da marcatori predittivi per la progressione della malattia.

Progettazione e procedure dello studio

Popolazione:

• I pazienti con diagnosi di Asah saranno reclutati prospetticamente da un centro neurochirurgico terziario.
• I pazienti reclutati in modo prospettico saranno anonimi e classificati in gruppi Dind e non Dind basati su criteri clinici e radiologici.
• I soggetti di controllo sano saranno abbinati per età, sesso, razza ed etnia utilizzando un set di dati disponibile pubblicamente (GSE246337).

Raccolta ed elaborazione dei dati:

• I campioni di sangue intero periferico (10 mL) saranno raccolti entro giorni 1-4 post-emorragia prima dell'inizio del vasospasmo.
• Il DNA verrà estratto usando il metodo di salting-out, seguito dalla conversione del bisolfito per la profilazione della metilazione.
• L'analisi della metilazione del DNA a livello del genoma verrà eseguita utilizzando il microarray di beadchip V2.0 di Infinium Metilatepic, che copre siti CPG ~ 850K.
• La genotipizzazione verrà eseguita utilizzando Illumina Global Screening Array (GSA-24) v3.0 costituito da oltre 654.000 loci unici. Il software Plink V1.9 verrà utilizzato per il filtro variante e le analisi statistiche. Consideriamo in questa analisi solo SNP bi-allelici sugli autosomi. Se questa analisi produce associazioni significative tra SNP e DIND, i loci del tratto quantitativo della metilazione saranno analizzati per l'esame di interazioni a lungo raggio tra SNP rilevanti e siti CPG differenzialmente metilati. Queste interazioni SNP-metilazione potrebbero fornire dati unici e nuovi sul meccanismo del vasospasmo.

• L'elaborazione dei dati verrà eseguita utilizzando il pacchetto Sesame R con rigorose misure di controllo della qualità, tra cui:

  • Rimozione delle sonde che abbracciano SNP con una frequenza di allele minore> 1%.
  • Filtrando sonde con conteggio a bassa perle o valori p di rilevamento.
  • Esclusione delle sonde associate al cromosoma sessuale e sonde mappate in modo errato.

Diagnosi di Dind:

• Dind sarà clinicamente definito come un nuovo deficit neurologico focale o un declino della scala di coma (GCS) di Glasgow (GCS) di ≥2 punti, che dura> 1 ora e non attribuibile ad altre cause come idrocefalo, iponatremia o rebleding.
• La conferma radiologica del vasospasmo si baserà su risultati di angiografia cerebrale, angiografia CT (CTA) o Doppler transcranica (TCD).

Piano di analisi statistica

Sonde differenzialmente metilate (DMP):

• L'identificazione dei DMP verrà condotta utilizzando modelli di regressione lineare, con correzione Benjamini-Hochberg per confronti multipli.
• Solo i siti CPG con un valore Δβ assoluto> 5% e un valore p adeguato <0,05 saranno considerati significativi.
• Gli orologi epigenetici (orologio Horvath, orologio Hannum, orologio da sangue, orologio di fenoggio, orologio da smorza) stimerà l'età biologica in base ai modelli di metilazione del DNA in siti CPG specifici

Analisi dell'apprendimento automatico:

• La regressione di Lazo verrà applicata per la selezione delle caratteristiche per identificare i modelli di metilazione più predittivi di ASAH vs. Controlli sani e Dind vs. Dind.
• Le prestazioni dei modelli predittivi saranno valutate utilizzando la metrica R².

Analisi dell'arricchimento funzionale:

• L'analisi dell'arricchimento del set di geni (GSEA) utilizzando la funzione "Gene2Func" della mappatura funzionale e l'annotazione della piattaforma di studi di associazione a livello di genoma (FUMA GWAS) e l'arricchimento delle regioni genomiche dello strumento di annotazioni (Great) verranno utilizzati per identificare le vie biologiche associate a significative cambiamenti di metilazione.
• L'analisi del percorso si concentrerà sulla risposta immunitaria, la neuroinfiammazione, la disfunzione endoteliale e il metabolismo del fosforo, poiché questi processi sono stati implicati in patofisiologia di Asah.

Assicurazione della qualità e convalida dei dati

Convalida dei dati interni:

• Verranno utilizzati controlli di dati automatizzati per identificare le incoerenze nei profili di metilazione.
• L'analisi comparativa con i set di dati di riferimento garantirà che i modelli di metilazione si allineino con meccanismi biologici noti.

Verifica dei dati di origine:

• I profili di metilazione saranno controllati con database disponibili al pubblico per garantire coerenza con precedenti studi di associazione a livello di epigenoma.
• I dati demografici e clinici del paziente saranno verificati rispetto alle cartelle cliniche elettroniche per garantire l'accuratezza.

Gestione dei dati mancanti:

• Se mancano dati di metilazione per siti CPG specifici o al di sotto delle soglie di rilevamento, questi siti saranno esclusi dall'analisi.
• I dati clinici mancanti verranno gestiti utilizzando più metodi di imputazione per ridurre al minimo la distorsione.

Giustificazione delle dimensioni del campione

Composizione di coorte:

• 61 pazienti Asah (32 con Dind, 29 senza dind).
• 61 controlli sani abbinati da GSE246337.

La dimensione del campione relativamente piccola è stata scelta in base a precedenti studi EWAS in limiti di Asah e direzioni future

Limitazioni specifiche del tessuto:

o Lo studio utilizza il DNA del sangue periferico, che potrebbe non riflettere completamente i cambiamenti di metilazione nella vascolarizzazione cerebrale. Studi futuri dovrebbero convalidare i risultati nella parete arteriosa del vaso interessato usando modelli di ratto a bassa mortalità o liquido cerebrospinale.

Limitazioni del sottogruppo Dind:

o A causa della dimensione del campione relativamente piccola, i risultati relativi a Dind richiederanno la convalida esterna in coorti più grandi.

Conclusione Questo studio mira a fornire nuove intuizioni sui cambiamenti epigenetici associati a Asah e Dind. Identificando i siti CPG differenzialmente metilati, lo studio cerca di migliorare la scoperta dei biomarcatori per la stratificazione precoce del rischio e potenziali obiettivi terapeutici nei pazienti con Asah.