Epigenomin laajuinen DNA-metylaatioprofilointi aneurysmaalisessa subaraknoidisessa verenvuodossa ja viivästyneessä iskeemisessä neurologisessa alijäämässä

Tämä on tulevaisuuden havainnollista tapauskontrollia epigenomin laajuinen assosiaatiotutkimus (EWAS), joka on suunniteltu tutkimaan DNA-metylaatiomuutoksia potilaiden perifeerisessä veressä, joilla on aneurysmaalista subaraknoidisia verenvuotoa (ASAH) ja niiden potentiaalista yhteyttä viivästyneeseen iskeemiseen neurologiseen alijäämään (DIND). Tutkimuksen tavoitteena on tunnistaa epigeneettiset biomarkkerit, jotka voivat vaikuttaa ASAH: n ja DIND: n patofysiologiaan, sekä arvioida, voivatko nämä metylaatiomallit toimia ennustavina markkereina taudin etenemiselle.

Opintojen suunnittelu ja menettelytavat

Väestö:

• Potilaat, joille on diagnosoitu ASAH, rekrytoidaan tulevaisuudennäkymäksi tertiäärisestä neurokirurgisesta keskuksesta.
• Prospektiivisesti rekrytoidut potilaat anonyymittiin ja luokitellaan DIND- ja ei-jahtaaviin ryhmiin, jotka perustuvat kliinisiin ja radiologisiin kriteereihin.
• Terveelliset kontrollikohteet vastaavat iästä, sukupuolesta, rodusta ja etnisyydestä julkisesti saatavilla olevan tietojoukon (GSE246337) avulla.

Tiedonkeruu ja käsittely:

• Perifeeriset kokoverinäytteet (10 ml) kerätään muutamassa päivässä 1-4 verenvuodon jälkeen ennen vasospasmin alkamista.
• DNA uutetaan käyttämällä suola-out-menetelmää, jota seuraa bisulfiitin muuntaminen metylaatioprofilointia varten.
• Genomin laajuinen DNA-metylaatioanalyysi suoritetaan käyttämällä infinium metylaatiopic v2.0 -helmikisaromarjoa, joka peittää ~ 850K CpG -kohdat.
• Genotyyppien määritys suoritetaan käyttämällä Illumina Global Seulontaryhmää (GSA-24) v3.0, joka koostuu yli 654 000 ainutlaatuisesta lokuksesta. PLINK V1.9 -ohjelmistoa käytetään varianttien suodatus- ja tilastollisiin analyyseihin. Tarkastelemme tässä analyysissä vain bi-allelic SNP: t autosomeissa. Jos tämä analyysi tuottaa merkittäviä assosiaatioita SNP: ien ja DIND: n välillä, metylaatiokvantitatiiviset piirre lokukset analysoidaan asiaankuuluvien SNP: ien ja metyloitujen CPG-kohtien välisten pitkän kantaman vuorovaikutusten tutkimiseksi. Nämä SNP-metylaatiovuorovaikutukset voisivat tarjota ainutlaatuista ja uutta tietoa vasospasm-mekanismista.

• Tietojenkäsittely suoritetaan käyttämällä Sesame R -pakettia, jolla on tiukat laadunvalvontatoimenpiteet, mukaan lukien:

  • SNP: ien kattavien koettimien poistaminen pienellä alleelitaajuudella> 1%.
  • Suodattaa koettimet, joilla on alhainen helmen määrä tai havaitseminen p-arvot.
  • Sukupuolikromosomiin liittyvien koettimien ja virheellisesti kartoitettujen koettimien poissulkeminen.

Dindin diagnoosi:

• DIND määritellään kliinisesti uudeksi fokusoidun neurologiseksi alijäämäksi tai Glasgow -kooma -asteikolla (GCS) ≥2 pistettä, joka kestää> 1 tunti eikä johdu muista syistä, kuten hydrocephalus, hyponatremia tai reledending.
• Vasospasmin radiologinen vahvistus perustuu aivojen angiografiaan, CT -angiografiaan (CTA) tai transkraniaaliseen Doppler (TCD) -havaintoihin.

Tilastollinen analyysisuunnitelma

Erilaisesti metyloidut koettimet (DMP):

• DMP: ien tunnistaminen suoritetaan lineaaristen regressiomallejen avulla, kun Benjamini-Hochbergin korjaus on useita vertailuja varten.
• Vain CPG-kohdat, joissa on absoluuttinen Ap-arvo> 5% ja säädetty p-arvo <0,05, pidetään merkittävinä.
• Epigeneettiset kellot (Horvath Clock, Hannum -kello, Skinveren kello, Phenoage Clock, Grimage Clock) arvioi biologisen iän DNA -metylaatiokuvioiden perusteella tietyissä CPG -kohdissa

Koneoppimisanalyysi:

• Lasso-regressiota sovelletaan ominaisuuksien valintaan metylaatiokuvioiden tunnistamiseksi, jotka ennustavat ASAH: ta vs. terveelliset kontrollit ja dind vs. ei-dind.
• Ennustavien mallien suorituskyky arvioidaan R² -mittarin avulla.

Funktionaalinen rikastusanalyysi:

• Geenisarjan rikastusanalyysi (GSEA) käyttämällä genomin laajuisen assosiaatiotutkimusalustan (FUMA GWAS) funktionaalisen kartoituksen ja merkintätutkimusalustan (FUMA GWAS) ja merkintöjen rikastustyökalun (Great) funktiota ja merkintöjä käytetään merkittävien metylaatiomuutosten biologisten reittien tunnistamiseen.
• Polkuanalyysi keskittyy immuunivasteeseen, neuroinflammaatioon, endoteelin toimintahäiriöihin ja fosforin aineenvaihduntaan, koska nämä prosessit ovat vaikuttaneet ASAH -patofysiologiaan.

Laadunvarmistus ja tietojen validointi

Sisäisen tiedon validointi:

• Automatisoituja tietotarkastuksia käytetään metylaatioprofiilien epäjohdonmukaisuuksien tunnistamiseen.
• Vertaileva analyysi vertailutietojoukkoihin varmistetaan, että metylaatiomallit ovat yhdenmukaisia ​​tunnettujen biologisten mekanismien kanssa.

Lähdetietojen todentaminen:

• Metylaatioprofiilit tarkistetaan ristiin julkisesti saatavilla olevien tietokantojen kanssa johdonmukaisuuden varmistamiseksi aiempien epigenomien laajuisten assosiaatiotutkimusten kanssa.
• Potilaan demografiset ja kliiniset tiedot varmennetaan sähköisen sairauskertomuksen suhteen tarkkuuden varmistamiseksi.

Puuttuvien tietojen käsittely:

• Jos tiettyjen CPG -kohtien metylaatiotiedot puuttuvat tai sen alapuolella havaitsemiskynnykset, nämä kohdat jätetään analyysin ulkopuolelle.
• Puuttuvaa kliinistä tietoa käsitellään käyttämällä useita imputointimenetelmiä puolueellisuuden minimoimiseksi.

Otoksen kokoinen perustelu

Kohortin koostumus:

• 61 ASAH -potilasta (32 Dind, 29 ilman Dind).
• 61 GSE246337: n vastaiset terveelliset kontrollit.

Suhteellisen pieni otoskoko valittiin aikaisempien EWAS -tutkimusten perusteella ASAH -rajoituksissa ja tulevaisuuden suunnissa

Kudosspesifiset rajoitukset:

o Tutkimuksessa käytetään perifeeristä veri -DNA: ta, mikä ei välttämättä heijasta täysin aivojen verisuonten metylaatiomuutoksia. Tulevien tutkimusten tulisi validoida havainnot, jotka ovat aluksen valtimoiden seinämässä, käyttämällä matalakuormitusta rottimalleja tai aivo-selkäydinnestettä.

Dind -alaryhmän rajoitukset:

o Suhteellisen pienen näytteen koon vuoksi DIND: hen liittyvät havainnot vaativat ulkoisen validoinnin suuremmilla kohortilla.

Johtopäätös Tämän tutkimuksen tavoitteena on tarjota uusia näkemyksiä ASAH: n ja DIND: hen liittyvistä epigeneettisistä muutoksista. Tunnistamalla erilaiset metyloituneet CPG -kohdat, tutkimuksella pyritään parantamaan biomarkkereiden löytämistä varhaisen riskin stratifioinnin ja mahdollisten terapeuttisten kohteiden suhteen ASAH -potilailla.