Epigenom-bred DNA-methyleringsprofilering i aneurysmal subarachnoid blødning og forsinket iskæmisk neurologisk underskud

Dette er en prospektiv observations-case-control epigenom-bred associeringsundersøgelse (EWAS) designet til at undersøge DNA-methyleringsændringer i perifert blod fra patienter med aneurysmal subarachnoid blødning (ASAH) og deres potentielle tilknytning til forsinket iskæmisk neurologisk underskud (Dind). Undersøgelsen sigter mod at identificere epigenetiske biomarkører, der kan bidrage til patofysiologien af ​​Asah og Dind, samt at vurdere, om disse methyleringsmønstre kan tjene som forudsigelige markører for sygdomsprogression.

Undersøgelsesdesign og procedurer

Befolkning:

• Patienter, der er diagnosticeret med ASAH, rekrutteres prospektivt fra et tertiært neurokirurgisk center.
• De prospektivt rekrutterede patienter vil blive anonymiseret og klassificeret i Dind- og ikke-dindgrupper baseret på kliniske og radiologiske kriterier.
• Sunde kontrolpersoner vil blive matchet for alder, køn, race og etnicitet ved hjælp af et offentligt tilgængeligt datasæt (GSE246337).

Dataindsamling og behandling:

• Perifere helblodprøver (10 ml) opsamles inden for dage 1-4 efter blødning før begyndelsen af ​​vasospasme.
• DNA ekstraheres ved anvendelse af saltningsmetoden efterfulgt af bisulfitkonvertering til methyleringsprofilering.
• Genomyleringsanalyse af genom-bredt DNA-methylering vil blive udført under anvendelse af Infinium Methyleringepic V2.0 BeadChip Microarray, der dækker ~ 850K CpG-steder.
• Genotyping udføres ved hjælp af Illumina Global Screening Array (GSA-24) v3.0 bestående af over 654 000 unikke loci. Plink v1.9 -software vil blive brugt til variantfiltrering og statistiske analyser. Vi overvejer i denne analyse kun bi-alleliske SNP'er på autosomer. Hvis denne analyse giver signifikante sammenhænge mellem SNP'er og Dind, vil der blive analyseret methylering af kvantitative egenskaber til undersøgelse af langtrækkende interaktioner mellem relevante SNP'er og differentielt methylerede CpG-steder. Disse SNP-methyleringsinteraktioner kunne give unikke og nye data om vasospasmemekanismen.

• Databehandling udføres ved hjælp af Sesame R -pakke med strenge kvalitetskontrolforanstaltninger, herunder:

  • Fjernelse af sonder, der spænder over SNP'er med en mindre allelfrekvens> 1%.
  • Filtrering af sonder med lavt perleantal eller detektion P-værdier.
  • Ekskludering af kønskromosom-associerede sonder og forkert kortlagte sonder.

Diagnose af Dind:

• Dind vil blive klinisk defineret som et nyt fokalt neurologisk underskud eller Glasgow Coma Scale (GCS) nedgang på ≥2 point, der varer> 1 time og ikke kan tilskrives andre årsager, såsom hydrocephalus, hyponatræmi eller genblødning.
• Radiologisk bekræftelse af vasospasme vil være baseret på cerebral angiografi, CT -angiografi (CTA) eller transkranial Doppler (TCD) fund.

Statistisk analyseplan

Differentielt methylerede prober (DMP'er):

• Identifikation af DMP'er udføres ved hjælp af lineære regressionsmodeller med Benjamini-Hochberg-korrektion for flere sammenligninger.
• Kun CPG-steder med en absolut Δβ-værdi> 5% og en justeret p-værdi <0,05 vil blive betragtet som signifikant.
• Epigenetiske ure (Horvath Clock, Hannum Clock, Skinblood Clock, Phenoage Clock, Grimage Clock) vil estimere biologisk alder baseret på DNA -methyleringsmønstre på specifikke CPG -steder

Maskinindlæringsanalyse:

• Lasso-regression vil blive anvendt til valg af funktion til at identificere methyleringsmønstre, der er mest forudsigelig for Asah vs. sunde kontroller og Dind vs. ikke-afgang.
• Ydeevne af de forudsigelige modeller vurderes ved hjælp af R² -metrien.

Funktionel berigelseanalyse:

• GENE SET Berigelsesanalyse (GSEA) ved hjælp af "Gene2Func" -funktion af funktionel kortlægning og annotation af genom-dækkende associeringsstudier platform (FUMA GWAS) og genomiske regioner Berigelse af annotationsværktøj (Great) vil blive brugt til at identificere biologiske veje forbundet med betydelige methyleringsændringer.
• Pathway -analyse vil fokusere på immunrespons, neuroinflammation, endotel -dysfunktion og fosformetabolisme, da disse processer er blevet impliceret i Asah -patofysiologi.

Kvalitetssikring og datavalidering

Intern datavalidering:

• Automatiske datakontrol vil blive brugt til at identificere uoverensstemmelser i methyleringsprofiler.
• Sammenlignende analyse mod referencedatasæt vil sikre, at methyleringsmønstre er i overensstemmelse med kendte biologiske mekanismer.

Kildedata -verifikation:

• Methyleringsprofiler vil blive krydskontrolleret med offentligt tilgængelige databaser for at sikre konsistens med tidligere epigenom-brede foreningsundersøgelser.
• Patientdemografiske og kliniske data vil blive verificeret mod elektroniske medicinske poster for at sikre nøjagtighed.

Håndtering af manglende data:

• Hvis methyleringsdata for specifikke CPG -steder mangler eller under detektionsgrænser, vil disse steder blive udelukket fra analyse.
• Manglende kliniske data håndteres ved hjælp af flere imputationsmetoder til at minimere bias.

Prøvestørrelse Begrundelse

Kohortkomposition:

• 61 ASAH -patienter (32 med Dind, 29 uden Dind).
• 61 matchede sunde kontroller fra GSE246337.

Den relativt lille prøvestørrelse blev valgt baseret på tidligere EWAS -studier i ASAH -begrænsninger og fremtidige retninger

Vævsspecifikke begrænsninger:

o Undersøgelsen bruger perifert blod -DNA, som muligvis ikke fuldt ud afspejler methyleringsændringer i cerebral vaskulatur. Fremtidige undersøgelser bør validere fund i arterievæggen i det berørte kar ved hjælp af rottemodeller med lav mortalitet eller cerebrospinalvæske.

Dind undergruppebegrænsninger:

o På grund af den relativt lille prøvestørrelse kræver fund relateret til Dind ekstern validering i større kohorter.

Konklusion Denne undersøgelse har til formål at give ny indsigt i epigenetiske ændringer forbundet med Asah og Dind. Ved at identificere differentielt methylerede CPG -steder søger undersøgelsen at forbedre biomarkørens opdagelse til tidlig risikostratificering og potentielle terapeutiske mål hos ASAH -patienter.