Obnova svalů po suplementaci omega-3

Výzkumná otázka Snižuje suplementace vysokými dávkami omega-3 po dobu osmi týdnů poškození svalů vyvolané jednorázovou vysokointenzivní excentrickou zátěží u mladých mužů? Souvisí reakce na excentrické cvičení se zvýšením oxylipinů odvozených od omega-3 mastných kyselin? Hypotéza Dlouhodobá suplementace (8 týdnů) vysokými dávkami omega-3 (3 g/den) zvýší koncentraci oxylipinů v krvi, což bude spojeno s menším poškozením svalů po protokolu excentrického cvičení u mladých mužů.

Obecný cíl Stanovit účinek osmitýdenní suplementace vysokými dávkami omega-3 mastných kyselin na hladiny oxylipinů v krvi a nepřímé markery poškození svalů po vysokointenzivním excentrickém cvičení u mladých mužů.

Konkrétní cíle

1. Stanovit účinek osmitýdenní suplementace vysokými dávkami omega-3 mastných kyselin na hladiny oxylipinů v krvi po vysokointenzivním excentrickém cvičení u mladých mužů.
2. Stanovit účinek osmitýdenní suplementace vysokými dávkami omega-3 mastných kyselin na svalovou funkci a markery poškození svalů po vysokointenzivním excentrickém cvičení u mladých mužů.
3. Spojit hladiny oxylipinů v krvi se změnami svalové funkce a markerů poškození svalů vyvolaných jednorázovou excentrickou zátěží před a po suplementaci vysokými dávkami omega-3 mastných kyselin u mladých mužů.

Metodologie Tato studie má experimentální, prospektivní, dvojitě zaslepený design. Velikost vzorku: Výpočet velikosti vzorku stanovuje minimálně 12 subjektů na skupinu na základě hladiny α 0,05 a síly (1-β) 0,8, za předpokladu odhadovaného maximálního rozdílu ztráty síly 22 % po excentrickém cvičení (velikost efektu = 1,06) mezi skupinami s omega-3 a kontrolní skupinou, na základě předchozí studie (1). Nicméně bude najato 15 účastníků na skupinu, aby se zohlednila 20% míra odpadnutí.

Metodologie: Bude rekrutováno třicet mladých mužů prostřednictvím plakátů a reklam na sociálních sítích. Účastníci budou náhodně přiřazeni dvojitě zaslepeným způsobem do dvou suplementačních skupin: (a) placebo (žlutý maltodextrin) nebo (b) omega-3 (EPA a DHA). Před zahájením suplementačního období podstoupí účastníci odběr žilní krve, testování nepřímých markerů poškození svalů, testování spotřeby kyslíku a protokol excentrického cvičení na jedné noze (6 sérií po 10 opakováních při 80 % 1 maxima opakování). Bezprostředně po, 1, 2, 24, 48, 72 a 96 hodin po excentrickém cvičení bude hodnoceno poškození svalů a budou získány vzorky žilní krve. Následující den začnou účastníci svůj 8týdenní suplementační protokol s omega-3 nebo placebem. Po suplementačním období účastníci provedou stejné testy jako na začátku a provedou excentrické cvičení na opačné noze.

Vylučovací kritéria: Účastníci nesměli provádět pravidelné silové tréninky během 6 měsíců před zahájením studie. Účastníci také nesmějí užívat léky ovlivňující zánět nebo kardiovaskulární reakce na cvičení a musí mít BMI nižší než 30 kg/m2. Nakonec účastníci nesmějí konzumovat ryby více než dvakrát týdně a nesměli užívat žádné doplňky s omega-3 tři měsíce před studií ani být alergičtí na ryby. Účastníci budou požádáni o očkování proti Covid-19. Účastníci budou plně informováni o povaze a možných rizicích experimentálních postupů před podepsáním informovaného souhlasu schváleného etickou komisí.

Suplementace: Účastníci budou suplementováni 5 kapslemi denně (5 g/den) přípravku Omega Up OMEGA 3 (2,5 g/den DHA a 0,5 g/den EPA) nebo placebem. Použitá dávka je v souladu s doporučením EFSA (Evropský úřad pro bezpečnost potravin), prokázala se jako bezpečná, začleňuje se do buněčných membrán a přináší významná zlepšení celkového zdraví (2,3).

Protokol excentrického cvičení: Protokol excentrického cvičení bude sestávat z 6 sérií po 10 opakováních leg pressu pod úhlem 45° prováděných při 80 % 1RM pouze v excentrické fázi, s 90 sekundami odpočinku mezi sériemi prováděnými na jedné noze (4). Koncentrickou fázi pohybu provede jeden z výzkumníků.

Dotazníky: Budou provedeny dva dotazníky, první o frekvenci konzumace potravin, zaměřený na kvantifikaci průměrného příjmu omega-3 mastných kyselin ze stravy. Za druhé bude použit validovaný dotazník IPAQ ke kvantifikaci fyzické aktivity účastníků (5).

Test spotřeby kyslíku: Účastníci provedou stupňovaný test na cykloergometru (Lifecycle 9500HR; LifeFitness, Rosemont, IL, USA). Získány budou hodnoty maximálního výkonu a VO2peak. Test začne 4 minutami při 50 W a bude se zvyšovat o 25 W každou minutu do vyčerpání (6).

Maximální izometrická síla (MVC): MVC extenzorů kolena obou nohou bude měřena při 90° flexi kolena na židli pro kvadricepsy vybavené tenzometrem (Reverse S, USA). Z tohoto hodnocení bude vypočítána rychlost rozvoje síly (RFD) jako citlivější marker svalové ztuhlosti a funkce.

Bolest svalů: Bolest stehen při sezení a vstávání ze židle 3krát bude hodnocena pomocí vizuální analogové škály (100 cm), kde 0 je žádná bolest a 100 je maximální bolest.

Obvod stehna: Cvičená noha bude měřena ve střední oblasti. Měření provede třikrát stejný vyšetřovatel a pro statistickou analýzu bude použit průměr těchto tří měření. Bude použito neroztažitelné měřicí pásmo. (Lufkin Executive Thinline, Maryland, USA)(7) Aktivita kreatinkinázy (CK): Z krevního vzorku (níže) bude extrahováno 35uL a analyzována aktivita CK v krvi (Reflotron, Roche).

Vzorky krve: Budou získány vzorky žilní krve a okamžitě centrifugovány pro získání plazmy (1000 g po dobu 10 minut při 4°C) a frakce erytrocytů (3000 × g po dobu 10 minut při 20°C). Obě frakce budou zmraženy při -80°C.

Složení mastných kyselin fosfolipidů (analýza mastných kyselin v krvi a GR): Kvantitativní extrakce celkových lipidů z erytrocytů a plazmy bude provedena podle Bligha a Dyera (8) s přídavkem BHT. Methylestery mastných kyselin (FAME) z erytrocytů a plazmy budou připraveny podle Morrisona a Smithe (9). FAME budou extrahovány 0,5 ml hexanu. FAME budou identifikovány a kvantifikovány plynovou kapalinovou chromatografií na zařízení Agilent (model 7890B, Santa Clara, CA, USA) vybaveném kapilární kolonou (Agilent HP-88, 100 m × 0,250 mm; ID 0,25 μm) a detektorem s plamenovou ionizací (FID). Identifikace a kvantifikace FAME bude dosažena porovnáním retenčních časů a hodnot procentuální plochy píků neznámých vzorků s komerčním lipidovým standardem (Nu-Chek Prep Inc., Elysian, MN, USA). Jako vnitřní standard bude použit C23:0 (Nu-Chek Prep Inc., Elysian, MN, USA). Data budou zpracována pomocí softwarového systému Hewlett-Packard Chemstation.

Analýza SPM lipidových mediátorů v plazmě: Vzorky plazmy (400 μL) budou analyzovány v duplikátu na oxylipiny pomocí HPLC/MS/MS, jak bylo popsáno dříve (10). Stručně řečeno, deuterované vnitřní standardy (Cayman Chemicals) budou přidány do vzorků plazmy a upraveny na pH <3,0 před extrakcí na pevné fázi pomocí kolon Strata-X-SPE (Phenomenex) podmíněných methanolem, následovaných vodou při pH 3,0. Vzorky budou naloženy na kolony, promyty a volné SPM budou eluovány 100% methanolem. Eluát bude poté vysušen a rozpuštěn v rozpouštědle A (voda/acetonitril/mravenčí kyselina, 70/30/0,02 v/v/v) pro analýzu oxylipinů pomocí HPLC/MS/MS, pomocí kolony Luna 5-μm C18 (100 Å, 250 × 2,0 mm, Phenomenex) na HPLC Shimadzu Nexera XR, připojené k ABSciex QTRAP 6500 MS pracujícímu v negativním režimu s elektrosprejovou ionizací. Oxylipiny budou eluovány s následujícím gradientem: 100 % rozpouštědla A mezi 0 a 1 min, poté rozpouštědlo B (acetonitril/isopropylalkohol, 50/50, v/v) je lineárně zvýšeno na 25 % při 3 min, 45 % při 11 min, 60 % při 13 min, 75 % při 18 min a 90 % při 18,5 min. Rozpouštědlo B je poté drženo na 90 % do 20 min, sníženo na 0 % při 21 min a drženo do 25 min. Oxylipiny budou kvantifikovány pomocí metody stabilního izotopového ředění.

Statistická analýza: Výsledky budou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka. Rozdíly budou hodnoceny pomocí dvoufaktorové analýzy rozptylu (ANOVA) s Fisher's post hoc testem (LSD) pro vícenásobná porovnání mezi skupinami a časovými body hodnocení. Hodnota p <0,05 bude považována za statisticky významnou.