Regeneracja Mięśni Po Suplementacji Omega-3

Pytanie badawcze Czy suplementacja wysokimi dawkami kwasów omega-3 przez osiem tygodni zmniejsza uszkodzenia mięśni wywołane sesją wysokointensywnych ćwiczeń ekscentrycznych u młodych mężczyzn? Czy odpowiedź na ćwiczenia ekscentryczne jest związana ze wzrostem oksylipin pochodzących z kwasów tłuszczowych omega-3? Hipoteza Długotrwała suplementacja (8 tygodni) wysokimi dawkami omega-3 (3 g/d) zwiększy stężenie oksylipin we krwi, co będzie związane z mniejszym uszkodzeniem mięśni po protokole ćwiczeń ekscentrycznych u młodych mężczyzn.

Cel ogólny Określenie wpływu ośmiotygodniowej suplementacji wysokimi dawkami kwasów tłuszczowych omega-3 na poziom oksylipin we krwi i pośrednie markery uszkodzenia mięśni po wysokointensywnych ćwiczeniach ekscentrycznych u młodych mężczyzn.

Cele szczegółowe

1. Określenie wpływu ośmiotygodniowej suplementacji wysokimi dawkami kwasów tłuszczowych omega-3 na poziom oksylipin we krwi po wysokointensywnych ćwiczeniach ekscentrycznych u młodych mężczyzn.
2. Określenie wpływu ośmiotygodniowej suplementacji wysokimi dawkami kwasów tłuszczowych omega-3 na funkcję mięśni i markery uszkodzenia mięśni po wysokointensywnych ćwiczeniach ekscentrycznych u młodych mężczyzn.
3. Powiązanie poziomu oksylipin we krwi ze zmianami w funkcji mięśni i markerach uszkodzenia mięśni wywołanymi sesją ćwiczeń ekscentrycznych, przed i po suplementacji wysokimi dawkami kwasów tłuszczowych omega-3 u młodych mężczyzn.

Metodologia Badanie ma charakter eksperymentalny, prospektywny, z podwójnie ślepą próbą. Wielkość próby: Obliczenie wielkości próby ustala minimum 12 osób na grupę na podstawie poziomu α 0,05 i mocy (1-β) 0,8, przy założeniu szacowanej maksymalnej różnicy utraty siły wynoszącej 22% po ćwiczeniach ekscentrycznych (wielkość efektu = 1,06) między grupą omega-3 i kontrolną, na podstawie poprzedniego badania (1). Jednakże, do każdej grupy zostanie zrekrutowanych 15 uczestników, aby uwzględnić 20% wskaźnik rezygnacji.

Metodologia: Trzydziestu młodych mężczyzn zostanie zrekrutowanych poprzez plakaty i reklamy w mediach społecznościowych. Uczestnicy zostaną losowo przydzieleni w sposób podwójnie ślepy do dwóch grup suplementacji: (a) placebo (żółta maltodekstryna) lub (b) omega-3 (EPA i DHA). Przed rozpoczęciem okresu suplementacji uczestnicy przejdą pobranie krwi żylnej, testy pośrednich markerów uszkodzenia mięśni, test konsumpcji tlenu oraz protokół ćwiczeń ekscentrycznych na jednej nodze (6 serii po 10 powtórzeń przy 80% 1 powtórzenia maksymalnego). Bezpośrednio po, 1, 2, 24, 48, 72 i 96 godzin po sesji ćwiczeń ekscentrycznych, zostanie ocenione uszkodzenie mięśni i pobrane próbki krwi żylnej. Następnego dnia uczestnicy rozpoczną 8-tygodniowy protokół suplementacji omega-3 lub placebo. Po okresie suplementacji uczestnicy wykonają te same testy co na początku oraz przeprowadzą sesję ćwiczeń ekscentrycznych na przeciwległej nodze.

Kryteria wykluczenia: Uczestnicy nie mogli regularnie trenować siłowo przez 6 miesięcy przed rozpoczęciem badania. Uczestnicy nie mogą również przyjmować leków wpływających na stan zapalny lub reakcje sercowo-naczyniowe na ćwiczenia oraz muszą mieć BMI poniżej 30 kg/m2. Wreszcie, uczestnicy nie mogą spożywać ryb więcej niż dwa razy w tygodniu i nie mogli przyjmować żadnych suplementów omega-3 przez trzy miesiące przed badaniem ani być alergiczni na ryby. Uczestnicy zostaną poproszeni o zaszczepienie się przeciw Covid-19. Uczestnicy zostaną w pełni poinformowani o charakterze i możliwych ryzykach procedur eksperymentalnych przed podpisaniem pisemnej świadomej zgody zatwierdzonej przez Komisję Etyki.

Suplementacja: Uczestnicy będą suplementowani 5 kapsułkami dziennie (5 g/d) Omega Up OMEGA 3 (2,5 g/d DHA i 0,5 g/d EPA) lub placebo. Stosowana dawka jest zgodna z zaleceniem EFSA (Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności), wykazano, że jest bezpieczna, wbudowuje się w błony komórkowe i powoduje znaczące poprawy w ogólnym zdrowiu (2,3).

Protokół ćwiczeń ekscentrycznych: Protokół ćwiczeń ekscentrycznych będzie składał się z 6 serii po 10 powtórzeń wyciskania nóg pod kątem 45° wykonanych przy 80% 1RM tylko w fazie ekscentrycznej, z 90 sekundami odpoczynku między seriami wykonanymi na jednej nodze (4). Fazę koncentryczną ruchu wykona jeden z badaczy.

Ankiety: Przeprowadzone zostaną dwie ankiety, pierwsza dotycząca częstotliwości spożycia żywności, skupiona na kwantyfikacji średniego spożycia kwasów tłuszczowych omega-3 z diety. Druga, wykorzystająca zwalidowany kwestionariusz IPAQ do kwantyfikacji aktywności fizycznej u uczestników (5).

Test konsumpcji tlenu: Uczestnicy wykonają test progresywny na ergometrze rowerowym (Lifecycle 9500HR; LifeFitness, Rosemont, IL, USA). Uzyskane zostaną wartości mocy maksymalnej i VO2peak. Test rozpocznie się od 4 minut przy 50 W i będzie zwiększany o 25 W co minutę do wyczerpania (6).

Maksymalna siła izometryczna (MVC): MVC prostowników kolana obu nóg będzie mierzona przy zgięciu kolana 90° na krześle do ćwiczenia mięśni czworogłowych wyposażonym w przetwornik siły (Reverse S, USA). Z tej oceny zostanie obliczona szybkość rozwoju siły (RFD) jako bardziej czuły marker sztywności i funkcji mięśni.

Ból mięśni: Ból uda podczas siadania i wstawania z krzesła 3 razy będzie oceniany za pomocą wizualnej skali analogowej (100 cm), gdzie 0 oznacza brak bólu, a 100 maksymalny ból.

Obwód uda: Ćwiczona noga będzie mierzona w środkowej części. Pomiary zostaną wykonane trzykrotnie przez tego samego badacza, a średnia z tych trzech pomiarów zostanie użyta do analizy statystycznej. Zostanie użyta nierozciągliwa taśma miernicza. (Lufkin Executive Thinline, Maryland, USA)(7) Aktywność kinazy kreatynowej (CK): 35uL zostanie pobrane z próbki krwi (poniżej) i przeanalizowane pod kątem aktywności CK we krwi (Reflotron, Roche).

Próbki krwi: Zostaną pobrane próbki krwi żylnej i natychmiast odwirowane w celu uzyskania osocza (1000 g przez 10 minut w 4°C) oraz frakcji erytrocytów (3000 × g przez 10 minut w 20°C). Obie frakcje będą zamrożone w -80°C.

Skład kwasów tłuszczowych fosfolipidów (analiza kwasów tłuszczowych we krwi i GR): Ilościowa ekstrakcja lipidów całkowitych z erytrocytów i osocza zostanie wykonana zgodnie z Bligh i Dyer (8) z dodatkiem BHT. Estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME) z erytrocytów i osocza zostaną przygotowane zgodnie z Morrison i Smith (9). FAME zostaną ekstrahowane 0,5 mL heksanu. FAME zostaną zidentyfikowane i skwantowane za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej na sprzęcie Agilent (model 7890B, Santa Clara, CA, USA) wyposażonym w kolumnę kapilarną (Agilent HP-88, 100 m × 0,250 mm; ID 0,25 μm) i detektor z jonizacją płomieniową (FID). Identyfikacja i kwantyfikacja FAME zostanie osiągnięta przez porównanie czasów retencji i wartości procentowych powierzchni pików nieznanych próbek z tymi z komercyjnego standardu lipidowego (Nu-Chek Prep Inc., Elysian, MN, USA). C23:0 zostanie użyty jako standard wewnętrzny (Nu-Chek Prep Inc., Elysian, MN, USA). Dane będą przetwarzane przy użyciu systemu oprogramowania Hewlett-Packard Chemstation.

Analiza SPM mediatorów lipidowych osocza: Próbki osocza (400 μL) będą analizowane w duplikacie pod kątem oksylipin za pomocą HPLC/MS/MS jak opisano wcześniej (10). Krótko, deuterowane standardy wewnętrzne (Cayman Chemicals) zostaną dodane do próbek osocza i dostosowane do pH <3,0 przed ekstrakcją na fazie stałej przy użyciu kolumn Strata-X-SPE (Phenomenex) wstępnie kondycjonowanych metanolem, a następnie wodą o pH 3,0. Próbki zostaną załadowane na kolumny, przepłukane, a wolne SPM zostaną eluowane 100% metanolem. Eluat następnie zostanie wysuszony i zawieszony w rozpuszczalniku A (woda/acetonitryl/kwas mrówkowy, 70/30/0,02 v/v/v) do analizy oksylipin za pomocą HPLC/MS/MS, przy użyciu kolumny Luna 5-μm C18 (100 Å, 250 × 2,0 mm, Phenomenex) na Shimadzu Nexera XR HPLC, sprzężonej z ABSciex QTRAP 6500 MS działającym w trybie ujemnym z jonizacją elektrorozpyleniową. Oksylipiny będą eluowane z następującym gradientem: 100% rozpuszczalnika A między 0 a 1 min, a następnie rozpuszczalnik B (acetonitryl/izopropyl alcohol, 50/50, v/v) jest liniowo zwiększany do 25% w 3 min, 45% w 11 min, 60% w 13 min, 75% w 18 min i 90% w 18,5 min. Rozpuszczalnik B jest następnie utrzymywany na 90% do 20 min, zmniejszony do 0% w 21 min i utrzymywany do 25 min. Oksylipiny będą kwantowane metodą stabilnego rozcieńczenia izotopowego.

Analiza statystyczna: Wyniki będą wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe. Różnice będą oceniane za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post hoc Fishera (LSD) dla wielokrotnych porównań między grupami i czasami oceny. Wartość p <0,05 będzie uznawana za statystycznie istotną.