DISC1-geenin mutaatioseulonta ja translokaation havaitseminen skitsofreniassa

Apurahaehdotuksella on kaksi suurta tutkimustavoitetta. Ensimmäinen tavoite on rakentaa E. coli -plasmidi, joka sisältää noin 1,4 kb:n DNA-sekvenssejä kustakin 700 bps:stä kromosomista 1q42.1 ja 11q14.3. keskeytyskohdan ympärillä. Toinen tavoite on denaturoivan korkean suorituskyvyn nestekromatografia (DHPLC) -menetelmien luominen mutaatioiden tai polymorfismien seulomiseksi kaikkien DISC1-geenin eksonien, 1 kb:n promoottorialueella ja 1 kb:n sekvenssien suhteen ylä- ja alavirtaan. keskeytyskohta.

Translokaatio (1q42.1;11q14.3) - Kannettu Plasmidi-DNA:n rakentaminen

Ihmisen genomisen DNA:n eristäminen Kaikkea ihmisen genomista DNA:ta käytetään näistä aiemmin kerätyistä koehenkilöistä tai henkilöistä, jotka on kerätty plasmidikonstruktiotutkimukseen spesifisesti tietoisella suostumuksella. Plasmidikonstruktiota varten mononukleaariset leukosyytit eristetään Böyumin (1968) menetelmän modifikaatiolla. Terveiltä vapaaehtoisilta otetaan kokoveri, jossa on EDTA:ta antikoagulanttina. Kerätty veri laimennetaan yhtä suurella tilavuudella fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja kerrostetaan Histopaque-1077:lle. Erottamisen jälkeen sentrifugoimalla 400 x g 40 minuutin ajan, mononukleaarinen leukosyyttikerros poistetaan ja pestään kolme kertaa PBS:llä sentrifugoimalla soluja 400 x g 10 minuutin ajan. Juuri eristettyjä soluja käytetään edelleen genomisen DNA:n eristämiseen tavanomaisten fenoli/kloroformi-uuttomenetelmien mukaisesti (Sambrook et ai. 1989).

1q42.1:n ja 11q14.3:n PCR-monistus DNA-sekvenssit Monistaminen suoritetaan AmpliTaq Gold DNA -polymeraasilla 50 ul:n reaktiotilavuudessa. Reaktio, joka sisälsi 50 ng DNA:ta, 1 U entsyymiä, 300 ng kutakin aluketta, 200 mM kutakin dNTP:tä, 1,5 mM MgCl2:a, 50 mM KCl:a ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 8,3. Kaikki reaktio suoritetaan ensimmäisellä 5 minuutin denaturointivaiheella 95 ℃:ssa, jota seuraa 35 sykliä denaturointivaihetta 94 ℃:ssa 30 sekunnin ajan, 1 minuutin pariutumisvaiheella käytetyille alukkeille sopivassa lämpötilassa ja synteesivaiheella. 72 ℃ 10 min. Alukesekvenssi 738 bps:n ylävirran katkaisupisteelle kohdassa 1q42.1 suunnitellaan EcoRI-leikkauskohdan kanssa katkaisupisteen päässä. Alukesekvenssi 719 bps:n alavirran katkaisupisteelle kohdassa 11q14.3 suunnitellaan myös siten, että katkaisupisteen päässä on EcoRI-leikkauskohta.

Kahden PCR-DNA-fragmentin liittäminen ja puhdistus geelielektroforeesilla Sekä 1q42.1:n että 11q14.3:n PCR-tuote saatetaan reagoimaan erikseen EcoRI:n kanssa koheesiivisten ligaatiokohtien paljastamiseksi. Kaksi DNA-fragmentista, kukin noin 700 emäsparia, liitetään T4 DNA-ligaasilla noudattaen InsT/AcloneTM-kloonauspakkauksesta (MBI Fermentas, U.S.A.) saatua protokollaa. Ligoitu 1,4 kb:n DNA-fragmentti monistetaan uudelleen yllä olevalla PCR-menettelyllä, puhdistetaan ja otetaan talteen agaroosigeelistä elektroeluoimalla ja uuttamalla orgaanisilla liuottimilla (Sambrook et ai. 1989).

Eristettyjen DNA-fragmenttien kloonaus E. coli -plasmidiin Puhdistettu 1,4 kb:n DNA-fragmentti (0,54 pmol päät) sekoitetaan plasmidivektorin pTZ57R/T DNA:n (0,165 ug, 0,18 pmol päät), 10x ligaatiopuskurin, PEG 4000 -liuoksen ja T4:n kanssa. ligaasi 5U. Seosta inkuboidaan 22 ℃:ssa 1 tunti. Kontrolliligaatioreaktio suoritetaan käyttämällä 4 ul:aa (168 ng, 0,54 pmol päät) kontrolli-PCR-fragmenttia, joka on saatu InsT/AcloneTM-kloonauspakkauksesta.

Plasmidien transformointi kompetenttiin E. coliin Transformaatio noudattaa InsT/AcloneTM-kloonauspakkauksen toimittamaa protokollaa. Kompetentit E. coli -bakteerin solut, DH5a-värjäys, siirrostetaan 2 ml:lla TransformAid C -elatusainetta pakastekalustosta ja viljelmää inkuboidaan yön yli 37 °C:ssa ravistelijassa. Esilämmitettyyn viljelyputkeen, joka sisältää 0,75 ml TransformAid C -elatusainetta, lisätään 0,075 ml yön yli viljeltyä E. colia ja sitä ravistellaan 37 °C:ssa 20 minuuttia.

Samat määrät 250 ul TransformAid T-liuosta A ja B sekoitetaan ja pidetään jäissä. 0,75 ml:n E. coli -viljelyputkea sentrifugoidaan 1 minuutin ajan 4 °C:ssa ja supernatantti heitetään pois. Lisäämällä 300 ul TransformAid T-liuosseosta, E. colia inkuboidaan jäillä 5 minuuttia ja sentrifugoidaan 1 minuutin ajan. Supernatantti hylätään ja 120 ui TransformAid T-liuosta lisätään ja inkuboidaan vielä 5 minuuttia jäillä. Ligaatioplasmidi 2,5 ul (10-20 ng) ja kontrolliligaatioseos 2 ul (10 ng vektori-DNA) valmistetaan ja istutetaan jäillä 2 minuuttia. 50 ui uudelleensuspendoituja E. coli -soluja lisätään kuhunkin ligaatioplasmidiin ja inkuboidaan jäissä 5 minuuttia. Solut, joissa on ligaatioplasmidi, maljataan esilämmitetylle LB-ampisilliiniagarlevylle ja inkuboidaan yön yli 37 °C:ssa. Kontrolliligaatioplasmidi tuottaa tavallisesti noin 90 % transformaatiotehokkuudesta.

Kloonien valinta ja E. coli -plasmidien eristäminen E. colin rekombinanttiset kloonit tunnistetaan valkoisen valinnan avulla, koska lacZ-geenin sisältävä vektori katkeaa insertiolla. Oikean plasmidin insertion läsnäolo varmistetaan edelleen PCR-reaktiolla. Plasmidi eristetään E. colista alkalisen lyysin menetelmällä (Liou et ai., 1999) tai kaupallisella plasmidin uuttopakkauksella. Yksittäinen solupesäke kerättiin seokseen, jossa oli 30 ul TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8,0) puskuria ja 60 ul SDS-NaOH (1 % SDS, 0,1 M NaOH) käännetään varovasti ylösalaisin ja inkuboidaan 5 minuuttia huoneenlämmössä. Seuraava 45 ul 3 M natriumasetaattiliuosta (pH 5,2) ja 130 ul kloroformia lisätään soluseokseen ja mikrosentrifugoidaan 5 minuuttia. Ylempi faasi kerätään ja lisätään 130 ul isopropanolia, sekoitetaan ja sentrifugoidaan 10 minuuttia. Plasmidi-DNA-pelletti pestään 100 ul:lla 70-prosenttisella etanolilla ja liuotetaan 10-20 ul:aan TE-puskuria.

PCR kaikkien potilaiden genomisen DNA:n katkaisupistealue Eristetty plasmidi-DNA ja kerätty skitsofreenisten potilaiden genominen DNA analysoidaan lisä-PCR-reaktiolla katkaisupistealueella alukeparilla, joka tulee molemmista kromosomeista 1 ja 11. PCR suoritetaan 50 ul:n tilavuudessa AmpliTaq Gold DNA -polymeraasilla. Reaktio, joka sisälsi 50 ng DNA:ta, 1 U entsyymiä, 300 ng kutakin aluketta, 200 mM kutakin dNTP:tä, 1,5 mM MgCl2:a, 50 mM KCl:a ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 8,3. Kaikki reaktiot suoritetaan 5 minuutin denaturaatiovaiheella 95 ℃:ssa, jota seuraa 35 sykliä denaturointivaihetta 94 ℃:ssa 30 sekunnin ajan, 1 minuutin pariutumisvaiheella käytetyille alukkeille sopivassa lämpötilassa ja synteesivaiheella. 72 ℃:ssa 10 min. Alukesekvenssejä sekä kromosomista 1q42.1 että 11q14.3 käytetään.

Tietojen analyysi PCR-tuloksen, jossa on vyöhyke noin 1,4 kb:n potilaan kohdalla, katsotaan olevan tasapainoinen translokaatio kromosomin 1q42.1 alueella. Ilmaantuvuus lasketaan jakamalla tasapainoisen translokaation omaavien potilaiden lukumäärä tässä kokeessa analysoitujen potilaiden kokonaismäärällä.

Odotetut vaikeudet ja ratkaisut

Jos tasapainoista translokaatiota ei tapahtunut yhdelläkään skitsofreniapotilaalla Taiwanissa. Tehdään seuraavat johtopäätökset:

1. Tämän laboratorion keräämillä potilailla ei ole tapahtunut tasapainoista translokaatiota kohdissa 1q42.1 ja 11q14.3.
2. Tasapainoinen translokaatioaste väestössä on melko alhainen, lähes nolla.
3. Tämä tulos ei välttämättä sulje pois mahdollisuutta DISC1-geenin ja skitsofrenian välisestä suhteesta.
4. Se osoittaa, että lisäkokeita on suoritettava sen arvioimiseksi, onko tällä alueella mitään sairauteen liittyvää mutaatiota tai polymorfismia, koska edellisessä kokeessamme olemme osoittaneet vahvan korrelaation tämän kromosomialueen ja taudin välillä.

Denaturoiva korkean suorituskyvyn nestekromatografia (DHPLC) DHPLC on tekniikka, jossa on etuja täysin automatisoidusta korkean suorituskyvyn analyysistä, joka on sovitettu PCR:n alukkeisiin ja erityisiin reagenssiryhmiin, eikä vaadi muuta näytteen esikäsittelyä kuin PCR (Xiao ja Oefner, 2001). Tämän tekniikan käyttäminen DNA-sekvenssin katkaisupistealueen seulomiseen nopeuttaa yhden nukleotidin polymorfismin tai skitsofreniaan liittyvien insertioiden ja deleetioiden mahdollisuutta havaita.

PCR ylävirran ja alavirran raja-alueen, eksonin 8 ja eksonin 9 DNA-fragmentit Kaikki kerätyt skitsofreenisten potilaiden genominen DNA analysoidaan PCR-reaktiolla ylä- ja alavirran 1 kb:n kohdalla ja eksoni 8 ja eksoni 9 peittävät osat. introneista kohti keskeytyspistettä. Koska optimaalinen DNA-fragmentin pituus DHPLC-analyysiä varten on noin 500 bps, jokaista PCR-reaktiota varten suunnitellaan seitsemän paria alukkeita. PCR suoritetaan 50 ul:n tilavuudessa AmpliTaq Gold DNA -polymeraasilla. Reaktio, joka sisälsi 50 ng DNA:ta, 1 U entsyymiä, 300 ng kutakin aluketta, 200 mM kutakin dNTP:tä, 1,5 mM MgCl2:a, 50 mM KCl:a ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 8,3. Kaikki reaktiot suoritetaan 5 minuutin denaturaatiovaiheella 95 ℃:ssa, jota seuraa 35 sykliä denaturointivaihetta 94 ℃:ssa 30 sekunnin ajan, 1 minuutin pariutumisvaiheella käytetyille alukkeille sopivassa lämpötilassa ja synteesivaiheella. 72 ℃:ssa 10 min. PCR-reaktioolosuhteet säädetään kustakin alukkeesta ennustetun Tm:n mukaan.

Denaturoiva HPLC-analyysi PCR-tuotteen DNA-fragmentti seulotaan ensin DHPLC-kromatografilla PCR-prosessista syntyneen puhtaan ja väkevän PCR-tuotteen arvioimiseksi. Mutaatio- ja polymorfismianalyysi suoritetaan menetelmän mukaisesti analyysijärjestelmällä Transgenomic WAVE HPLC:stä (Transgenomic) (Oefner ja Underhill, 1998). Jokaisen 500 bps:n PCR-tuotteet denaturoidaan 95 ℃:ssa 5 minuutin ajan ja jäähdytetään 65 ℃:seen heterodupleksien muodostamiseksi. DHPLC suoritetaan käyttämällä DNASep-kolonnia (Transgenomic), kuten on kuvattu (Kuklin et ai., 1997). Puskurin A koostumus on 0,1 M trietyyliammoniumasetaattia (TEAA) (transgenominen), ja puskuri B sisältää 0,1 M TEAA:ta, 25 % asetonitriiliä. Analyysi suoritetaan virtausnopeudella 0,9 ml/min ja puskurin B gradientin lisäyksellä 2 % minuutissa 4 minuutin ajan. Puskurin B alku- ja loppukonsentraatiot määritetään empiirisesti kullekin fragmentille. DNA:n eluoituminen pylväästä havaitaan absorbanssilla 260 nm:ssä. Optimaalinen lämpötila mutaatioiden havaitsemiseksi kullekin fragmentille on noin 1-2 ℃ ennen tai jälkeen Tm:n ja se määritetään empiirisesti kullekin fragmentille. Jos Wavemaker-ohjelmistoa käytetään osoittamaan, että amplikonissa oli sulamisalueita, HPLC suoritetaan näillä lämpötilojen lukumäärällä. Wave Sizing -standardi ja Wave Mutation -standardi arvioivat kolonnin resoluution ja kolonnin uunin tehokkuuden joka viikko.

RFLP ja PCR-fragmenttien suora sekvensointi DHPLC-kromatogrammien eluutioprofiilien eroja verrataan skitsofreniapotilaiden ja kontrollien välillä. Yksityiskohtaiset mutaatio- tai polymorfismisekvenssit lähetetään bioteknologiayritykselle lisäanalyysiä varten tai restriktiofragmentin pituuspolymorfismin (RFLP) avulla tiettyjen mutaatioiden tai polymorfismien tarkistamiseksi.

Tietojen analyysi DHPLC-tietojen analyysi perustuu näyte- ja vertailukromatogrammien subjektiiviseen vertailuun. Tässä ehdotuksessa käytämme kontrolleja ja sairaita potilaita referenssinä ja näytteinä. Huippuluku on tärkein kriteeri määritettäessä mutaation olemassaoloa. Useimmissa tapauksissa yksi kontrollinäytteessä havaittu huippu tuottaa kaksi, kolme tai neljä piikkiä mutaation läsnä ollessa. Piikin muoto auttaa tunnistamaan mutaatiot. Jotkut mutaatiot nähdään vain yksittäisen piikin muodon muutoksina.

Tulokset pisteytetään DHPLC-kromatogrammin eluutioprofiilin perusteella. Eri profiilit korreloivat sairauden oireen tai sairauden tilan kanssa. Eluutioprofiilin vahva korrelaatio mutaation tai polymorfismien osana sekvensoidaan.

Odotetut vaikeudet ja ratkaisut

1. Lisäsekvensointia ja vertailua aikaisempaan työhön käytetään DHPLC:n mutaatiotulosten tarkistamiseen.
2. Restriktiofragmentin pituuspolymorfismia (RFLP) käytetään myös, jos DHPLC on havainnut tietyn mutaation.

DHPLC:tä käytetään yhteisen tutkimustoimiston määräysten mukaisesti.