Скрининг мутаций и обнаружение транслокаций гена DISC1 при шизофрении

Предложение о предоставлении гранта преследует две основные исследовательские цели. Первой целью будет создание плазмиды E.coli, содержащей примерно 1,4 т.п.н. последовательностей ДНК из каждых 700 п.н. хромосом 1q42.1 и 11q14.3. вокруг точки останова. Второй целью будет разработка методов денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC) для скрининга мутаций или полиморфизмов для всех экзонов гена DISC1, 1 т.п.о. в промоторной области и последовательностей от 1 т.п.о. точка останова.

Транслокация (1q42.1; 11q14.3) - переносимая Конструкция плазмидной ДНК

Выделение геномной ДНК человека Всю геномную ДНК человека будут использовать от этих субъектов, собранных в прошлом, или от субъектов, собранных специально для исследования конструирования плазмиды с информированного согласия. Для конструирования плазмиды мононуклеарные лейкоциты выделяют модификацией метода Боюма (1968). Цельная кровь с ЭДТА в качестве антикоагулянта будет взята путем венепункции у здоровых добровольцев. Собранную кровь разводят равным объемом фосфатно-солевого буфера (PBS) и наносят слоями на Histopaque-1077. После разделения центрифугированием при 400×g в течение 40 минут слой мононуклеарных лейкоцитов удаляют и трижды промывают PBS путем центрифугирования клеток при 400×g в течение 10 минут. Свежевыделенные клетки будут далее применяться для выделения геномной ДНК в соответствии со стандартными процедурами экстракции фенолом/хлороформом (Sambrook et al., 1989).

ПЦР-амплификация 1q42.1 и 11q14.3 Последовательности ДНК Амплификацию проводят с ДНК-полимеразой AmpliTaq Gold в реакционном объеме 50 мкл. Реакция, содержащая 50 нг ДНК, 1 ЕД фермента, 300 нг каждого праймера, 200 мМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl и 10 мМ Трис-HCl, pH 8,3. Вся реакция будет проводиться с начальной стадией денатурации в течение 5 минут при 95 ℃, за которой следуют 35 циклов стадии денатурации при 94 ℃ в течение 30 секунд, стадия отжига в течение 1 минуты при температуре, соответствующей используемым праймерам, и стадия синтеза. при 72 ℃ в течение 10 мин. Последовательность праймеров для 738 п.н. от точки разрыва вверх по течению в 1q42.1 будет разработана с сайтом разрезания EcoRI на конце точки разрыва. Последовательность праймеров для 719 п.н. нижележащей точки разрыва 11q14.3 также будет сконструирована с сайтом разрезания EcoRI на конце точки разрыва.

Лигирование двух ПЦР-фрагментов ДНК и очистка с помощью гель-электрофореза. ПЦР-продукт 1q42.1 и 11q14.3 подвергают реакции с EcoRI по отдельности для выявления когезионных сайтов лигирования. Два фрагмента ДНК, около 700 п.н. каждый, будут лигированы с помощью ДНК-лигазы Т4 в соответствии с протоколом, предоставленным из набора для клонирования InsT/AcloneTM (MBI Fermentas, США). Лигированный фрагмент ДНК длиной 1,4 т.п.н. повторно амплифицируют описанной выше процедурой ПЦР, очищают и извлекают из агарозного геля с помощью электроэлюции и экстракции органическими растворителями (Sambrook et al., 1989).

Клонирование выделенных фрагментов ДНК в плазмиду E. Coli. Очищенный фрагмент ДНК длиной 1,4 т.п.н. (концы 0,54 пмоль) смешивают с ДНК плазмидного вектора pTZ57R/T (0,165 мкг, концы 0,18 пмоль), 10-кратным буфером для лигирования, раствором ПЭГ 4000 и Т4. лигаза 5U. Смесь инкубируют при 22℃ в течение 1 часа. Контрольную реакцию лигирования проводят с использованием 4 мкл (168 нг, 0,54 пмоль концов) контрольного ПЦР-фрагмента, предоставленного набором для клонирования InsT/AcloneTM.

Трансформация плазмид в компетентные штаммы E. Coli. Трансформация осуществляется в соответствии с протоколом, предусмотренным набором для клонирования InsT/AcloneTM. Компетентные клетки бактерий E.coli, окрашенные DH5α, инокулируют 2 мл среды TransformAid C из замороженного запаса и инкубируют культуру в течение ночи при 37℃ в шейкере. В предварительно нагретую культуральную пробирку, содержащую 0,75 мл среды TransformAid C, добавляют 0,075 мл культивируемых в течение ночи E.coli и встряхивают при 37°С в течение 20 мин.

Равные объемы 250 мкл Т-растворов TransformAid A и B смешивают и хранят на льду. 0,75 мл пробирки для культивирования E.coli центрифугируют в течение 1 мин при 4℃ и отбрасывают супернатант. Добавляя 300 мкл смеси растворов TransformAid T, E.coli инкубируют на льду в течение 5 минут и центрифугируют в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, добавляют 120 мкл Т-раствора TransformAid и инкубируют еще 5 мин на льду. Плазмиду для лигирования 2,5 мкл (10-20 нг) и контрольную смесь для лигирования 2 мкл (10 нг векторной ДНК) готовят и помещают на лед на 2 мин. 50 мкл ресуспендированных на льду клеток E.coli добавляют к каждой лигированной плазмиде и инкубируют на льду в течение 5 мин. Клетки с лигирующей плазмидой высевали на предварительно нагретую чашку с агаром с LB-ампициллином и инкубировали в течение ночи при 37 ℃. Контрольная плазмида для лигирования обычно обеспечивает около 90% эффективности трансформации.

Селекция клонов и выделение плазмид E.coli Рекомбинантные клоны E.coli будут идентифицированы с помощью белой селекции, поскольку вектор, несущий ген lacZ, будет разрушен вставкой. Наличие правильной вставки плазмиды будет дополнительно подтверждено реакцией ПЦР. Плазмиду выделяют из E.coli методом щелочного лизиса (Liou et al., 1999) или с помощью имеющегося в продаже набора для экстракции плазмиды. Одноклеточную колонию собирали в смеси с 30 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 7,4; 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и 60 мкл SDS-NaOH (1% SDS, 0,1 М NaOH). осторожно переворачивают и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем в смесь клеток добавляют 45 мкл 3М раствора ацетата натрия (рН 5,2) и 130 мкл хлороформа и микроцентрифугируют в течение 5 мин. Собирают верхнюю фазу и добавляют 130 мкл изопропанола, перемешивают и центрифугируют в течение 10 мин. Осадок плазмидной ДНК промывают 70% этанолом 100 мкл и растворяют в 10-20 мкл буфера ТЕ.

ПЦР область точки разрыва геномной ДНК всех пациентов. Выделенная плазмидная ДНК и собранная геномная ДНК пациентов с шизофренией будут проанализированы с помощью дальнейшей ПЦР-реакции в области точки разрыва с парой праймеров, происходящих от обеих хромосом 1 и 11. ПЦР будет проводиться в объеме 50 мкл с ДНК-полимеразой AmpliTaq Gold. Реакция, содержащая 50 нг ДНК, 1 ЕД фермента, 300 нг каждого праймера, 200 мМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl и 10 мМ Трис-HCl, pH 8,3. Вся реакция будет проводиться с начальной стадией денатурации в течение 5 минут при 95 ℃, за которой следуют 35 циклов стадии денатурации при 94 ℃ в течение 30 секунд, стадия отжига в течение 1 минуты при температуре, соответствующей используемым праймерам, и стадия синтеза. при 72 ℃ в течение 10 мин. Будут использованы последовательности праймеров как из хромосомы 1q42.1, так и из хромосомы 11q14.3.

Анализ данных Результат ПЦР с полосой около 1,4 т.п.о. пациента будет рассматриваться как имеющий сбалансированную транслокацию в области хромосомы 1q42.1. Уровень заболеваемости будет рассчитываться путем деления числа пациентов со сбалансированной транслокацией на общее количество пациентов, проанализированных в этом эксперименте.

Ожидаемые трудности и решения

Если сбалансированной транслокации не произошло ни у одного больного шизофренией Тайваня. Будут сделаны следующие выводы:

1. Сбалансированной транслокации 1q42.1 и 11q14.3 у пациентов, отобранных этой лабораторией, не произошло.
2. Сбалансированная скорость транслокаций в популяции достаточно низкая, почти нулевая.
3. Этот результат не исключает возможности связи между геном DISC1 и шизофренией.
4. Это указывает на то, что необходимо провести дальнейшие эксперименты, чтобы оценить, связаны ли какие-либо мутации или полиморфизмы в этой области с заболеванием, поскольку в нашем предыдущем эксперименте мы продемонстрировали сильную корреляцию между этой областью хромосомы и заболеванием.

Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (ДВЭЖХ) ДВЭЖХ — это метод, обладающий преимуществами полностью автоматизированного высокопроизводительного анализа, адаптированный к праймерам и определенным наборам реагентов для ПЦР и не требующий никакой предварительной обработки образца, кроме ПЦР (Xiao and Oefner, 2001). Использование этого метода для скрининга области точки разрыва последовательности ДНК ускорит обнаружение возможности наличия полиморфизма одиночных нуклеотидов или вставок и делеций, связанных с заболеванием шизофренией.

ПЦР область точки разрыва выше и ниже по течению, фрагменты ДНК экзона 8 и экзона 9. Вся собранная геномная ДНК пациентов с шизофренией будет проанализирована с помощью реакции ПЦР в 1 т.п.н. выше и ниже по течению от точки разрыва, а экзон 8 и экзон 9 покрыты части интронов к точке разрыва. Поскольку оптимальная длина фрагмента ДНК для анализа ДВЭЖХ составляет около 500 п.н., для каждой реакции ПЦР будет разработано семь пар праймеров. ПЦР будет проводиться в объеме 50 мкл с ДНК-полимеразой AmpliTaq Gold. Реакция, содержащая 50 нг ДНК, 1 ЕД фермента, 300 нг каждого праймера, 200 мМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl и 10 мМ Трис-HCl, pH 8,3. Вся реакция будет проводиться с начальной стадией денатурации в течение 5 минут при 95 ℃, за которой следуют 35 циклов стадии денатурации при 94 ℃ в течение 30 секунд, стадия отжига в течение 1 минуты при температуре, соответствующей используемым праймерам, и стадия синтеза. при 72 ℃ в течение 10 мин. Условия реакции ПЦР регулируют в соответствии с Tm, предсказанной для каждого праймера.

Анализ денатурирующей ВЭЖХ Фрагмент ДНК продукта ПЦР сначала подвергают скринингу на хроматографе ДВЭЖХ для оценки чистого и концентрированного продукта ПЦР, полученного в процессе ПЦР. Анализ мутаций и полиморфизма будет выполняться в соответствии с методом на системе анализа от Transgenomic WAVE HPLC (Transgenomic) (Oefner and Underhill, 1998). Продукты ПЦР каждого из 500 пар оснований будут денатурированы при 95℃ в течение 5 минут и охлаждены до 65℃ для образования гетеродуплексов. ДВЭЖХ будет проводиться с использованием колонки DNASep (Transgenomic), как описано (Kuklin et al., 1997). Состав буфера А будет представлять собой 0,1 М триэтиламмоний ацетат (ТЭАА) (трансгеномный), а буфер В будет содержать 0,1 М ТЭАА, 25% ацетонитрила. Анализ будет проводиться при скорости потока 0,9 мл/мин и увеличении градиента буфера В на 2% в минуту в течение 4 минут. Начальная и конечная концентрации буфера В будут определяться эмпирически для каждого фрагмента. Элюирование ДНК из колонки будет определяться по поглощению при 260 нм. Оптимальная температура для обнаружения мутаций для каждого фрагмента будет примерно на 1-2 ℃ до или после Tm и будет определяться эмпирически для каждого фрагмента. В тех случаях, когда программное обеспечение Wavemaker будет использоваться для указания количества доменов плавления, существующих в ампликоне, ВЭЖХ будет проводиться при этом количестве температур. Стандарт Wave Sizing и Wave Mutation будут оценивать разрешение колонки и эффективность печи колонки каждую неделю.

ПДРФ и прямое секвенирование фрагментов ПЦР Различия в профилях элюирования хроматограмм ДВЭЖХ будут сравниваться между пациентами с шизофренией и контрольной группой. Подробные последовательности мутаций или полиморфизмов будут отправлены в биотехнологическую компанию для дальнейшего анализа или с помощью полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) для проверки определенных мутаций или полиморфизмов.

Анализ данных Анализ данных ДВЭЖХ будет основан на субъективном сравнении хроматограмм образца и эталона. В настоящем предложении мы будем использовать контроли и больных пациентов в качестве эталонов и образцов. Номер пика будет наиболее важным критерием для определения наличия мутации. В большинстве случаев один пик, наблюдаемый в контрольном образце, будет давать два, три или четыре пика при наличии мутации. Форма пика поможет идентифицировать мутации. Некоторые мутации будут видны только как изменения формы одного пика.

Результаты будут оцениваться на основе профиля элюирования хроматограммы ДВЭЖХ. Различные профили будут коррелировать с симптомом заболевания или статусом заболевания. Будет секвенирована высокая корреляция профиля элюции как части мутации или полиморфизма.

Ожидаемые трудности и решения

1. Дальнейшее секвенирование и сравнение с нашей предыдущей работой будут использованы для проверки результатов мутации DHPLC.
2. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) также будет использоваться, если специфическая мутация была обнаружена с помощью DHPLC.

DHPLC будет использоваться в соответствии с правилами общего исследовательского офиса.