Biomarkkerit ja tautiaktiivisuus teriflunomidilla (Aubagio) hoidetuilla potilailla

OTSIKKO: Mahdollisten biomarkkerien yhdistäminen sairauden aktiivisuuteen potilailla, joita hoidetaan teriflunomidilla (Aubagio ®)

A. TAUSTA Teriflunomidi (Aubagio) on kerran päivässä annettava oraalinen immunomoduloiva DMT potilaille, joilla on relapsoiva-remittoiva MS (RRMS) (1). Tämän tutkimuksen tavoitteena on määrittää, ennustaako oletettu biomarkkerin tunnus taudin aktiivisuutta teriflunomidilla hoidetuilla potilailla. Tutkijat tunnistivat aiemmin immuuniaktivaatioon liittyvän 130 geenin allekirjoituksen, joka tunnisti MS-potilaat, joilla oli nopea siirtyminen sekundaariseen progressiiviseen MS-tautiin (SPMS). Tämän allekirjoituksen perusteella tutkijat tunnistivat kolme geeniä (TLR2, TLR4 ja CCR1), joilla oli lisääntynyt proteiinin ilmentyminen naiiveissa CD4-T-soluissa näillä potilailla. Tutkijat osoittivat myös, että lisääntymistä estävän tekijän, nimeltään TOB1, mRNA:n säätely heikkeni näissä T-soluissa potilailla, joilla MS-tauti eteni nopeasti. Löydökset viittaavat siis siihen, että naiivi CD4-T-soluaktivaatio tunnistaa MS-potilaat, joilla on lyhyt RRMS-kesto (2).

Tätä ehdotusta varten päätutkija ehdottaa, että erilaiset T-soluaktivaatioon osallistuvat molekyylit voivat myös toimia hyödyllisinä biomarkkereina ennustamaan hoitovasteita teriflunomidille.

B. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

B1. Opiskelutavoitteet ja erityistavoitteet. Tavoitteena on määrittää, ennustavatko aiemmin tunnistetut T-soluaktivaatiomarkkerit sairauden aktiivisuutta teriflunomidilla hoidetuilla potilailla.

Erityistutkimuksen tavoitteina on määrittää:

1. niiden potilaiden osuus esikäsittelystä (pre-Tx), joilla on muuttunut yhden tai useamman ehdokasmarkkerin ilmentyminen yhdessä tai useammassa T-alajoukossa;
2. muuttuvatko yhden tai useamman näistä markkereista ilmentymistasot T-alajoukossa teriflunomidihoidossa (On-Tx);
3. ennustavatko erot oletetun markkerin mRNA- tai proteiinikinetiikassa sairauden aktiivisuutta teriflunomidilla hoidetuilla potilailla;
4. korreloivatko yhden tai useamman kohdemolekyylin, Pre-Tx:n tai On-Tx:n, ekspressiotasot sairauden aktiivisuuden todisteiden kanssa vuoden hoidon jälkeen.

C. OPINTUSUUNNITTELU.

C1. Suunnittelun yhteenveto. Tutkimus on kaksivuotinen prospektiivinen havainnointitutkimus teriflunomidilla hoidetuilla potilailla. Tutkijat rekrytoivat lähtötilanteessa jopa 75 potilasta. Tutkijat tutkivat potilaita lähtötilanteessa ja väliajoin On-Tx teriflunomidilla tunnistaakseen potilaat, joilla on aktiivinen vs. stabiili sairaus kliinisen (relapsi) ja radiologisen (uudet hyperintensiiviset T2-leesiot) todisteiden perusteella. Tutkijat tutkivat biomarkkerien ilmentymistä kussakin potilasalaryhmässä.

C2. Ensisijaiset päätepisteet. Tutkimuksen keskeinen kysymys on, eroavatko yhden tai useamman oletetun biomarkkerin (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) ilmentymistasot näiden kahden informatiivisen alaryhmän potilaiden välillä.

C3. Tulostoimenpiteet. Tulokset, jotka käsittelevät tutkimuksen keskeistä kysymystä, ovat seuraavat:

1. TLR2:n, TLR4:n ja CCR1:n proteiinin ilmentymistasojen mittaukset CD4 T-alaryhmissä virtaussytometrialla.
2. TOB1 mRNA:n ilmentyminen CD4 T-alaryhmissä kvantitatiivisella RT-PCR:llä (qRT-PCR) ja PrimeFlow RNA -määrityksellä.
3. Erot valittujen markkerien mRNA- tai proteiiniekspressiossa lyhytaikaisissa viljelmissä näiden kahden informatiivisen alaryhmän potilaiden välillä.

C4. Kohdepopulaatio. Tutkimuspopulaatio sisältää:

1. aikaisemmin hoitamattomat RRMS-potilaat Montrealin neurologisen sairaalan (MNH) MS-klinikoilta ennen hoitoa (pre-Tx) teriflunomidilla; ja
2. RRMS-potilaat, joita on aiemmin hoidettu muilla sairautta modifioivilla hoidoilla (DMT), mutta jotka ovat siirtymässä teriflunomidiin.

C5. Eettinen hyväksyntä: Tutkimuksen hyväksyi MNH/MN:n Neurosciences Research Ethics Board. Tietoja säilytetään 7 vuotta.

C6. Suostumus. Päätutkija tai hänen edustajansa saa tietoon perustuvan suostumuksen

D. TUTKIMUSMENETTELYT. Tutkimuksessa tutkitaan biomarkkerin allekirjoitusta MS-potilailla, joita heidän neurologinsa hoitaa teriflunomidilla.

D1. Osallistujat ja klinikkakäynnit. Ennen teriflunomidihoidon aloittamista jokaiselle potilaalle tehdään kliininen arviointi, magneettikuvaus osana rutiininomaista kliinistä käytäntöä ja verikoe (katso alla). Ajoittain osallistujille tehdään kliininen arviointi ja toinen MRI-arviointi sen määrittämiseksi, onko heillä aktiivinen vai stabiili sairaus. Vaiheittaisen lähestymistavan mahdollistamiseksi neurologit pyrkivät tunnistamaan potilaat kuuden kuukauden hoidon jälkeen, joilla on merkkejä aktiivisesta vs. stabiilista sairaudesta, noin 3 kustakin alaryhmästä. Jokaiselta näistä potilaista otetaan verikokeet myöhempiä laboratoriotutkimuksia varten (katso alla).

D2. Näytekokoelma. Jopa 120 ml perifeeristä laskimoverta otetaan jokaiselta koehenkilöltä lähtötilanteessa ja väliajoin seerumin ja plasman keräämiseksi, lymfosyyttien kokonaismäärän, CD3-, CD4- ja CD8-lukujen määrittämiseksi ja perifeerisen veren mononukleaarisolujen (PBMC) eristämiseksi välittömästi. analysointia ja myös kylmäsäilytystä varten.

D3. Laboratorioanalyysi.

D3.1. Naiivi CD4 T-solujen eristäminen ja TOB1:n ilmentymisen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi. T-solujen lisääntymisen estäjän TOB1:n vähentynyt ilmentyminen korreloi nopean etenemisen kanssa CIS:stä RRMS:ksi yhdessä tutkimuksessa (2), ja myös tutkijoiden aikaisemmassa tutkimuksessa korreloi nopeaan etenemiseen RRMS:stä SPMS:ksi (2). Tutkijat eristävät naiiveja CD4-T-soluja käyttämällä MACS-helmiä (2) ja määrittävät TOB1:n ilmentymisen kvantitatiivisella RT-PCR:llä pienessä potilasryhmässä (5-10 potilasta) ja ikään sopivissa terveissä verrokeissa (HC).

D3.2. Kryosäilötyn PBMC:n analyysi.

Strategia 1. TLR2:n, TLR4:n ja CCR1:n pintaproteiiniekspressio CD4 T-alaryhmissä. Tutkijat analysoivat lähtötilanteen ja On-Tx-kylmäsäilytetyt näytteet TLR2:n, TLR4:n ja CCR1:n ilmentymisen (% positiivisuus ja MFI) suhteen naiivissa, keskusmuistissa, efektorimuistissa, terminaalisesti erilaistetuissa efektorimuistissa ja säätelevissä T-soluissa virtaussytometrisesti BD LSRFortessa -laitteella. 5 laserjärjestelmällä. Tutkijat käyttävät analyysiin FlowJo-ohjelmistoa. Tutkijat tunnistavat biomarkkerin, joka on informatiivisin, eli joka osoittaa suurimman eron ilmentymistasoissa potilaiden välillä kahdessa informatiivisessa alaryhmässä lähtötasolla tai hoidon aikana.

Strategia 2. TOB1 mRNA:n ilmentymisen vertailu qRT-PCR:llä ja PrimeFlow RNA -määrityksellä. Tutkijat kehittävät PrimeFlow™ RNA -määrityksen (affymetrix Ebioscience) mRNA:n ja proteiinin ilmentymisen samanaikaista analysointia varten. Aluksi tutkijat vertaavat TOB1-mRNA-ilmentymistä qRT-PCR:llä saatuun ilmentymiseen, koska qRT-PCR on kultainen standardi mRNA:n kvantifiointiin. Tutkijat vertaavat TOB1-mRNA-ilmentymistä naiiveissa CD4-T-soluissa kahdella menetelmällä. Jos mittaukset ovat vertailukelpoisia, tutkijat voivat samanaikaisesti arvioida TOB1:n ilmentymistä naiiveissa CD4 T-soluissa ja informatiivisimman biomarkkerin ilmentymistä CD4 T-alaryhmissä ja vertailla ekspressiotasoja kahdesta informatiivisesta alaryhmästä, kuten alla on kuvattu. .

Strategia 3. TOB1:n ja T-solubiomarkkerin mRNA- ja proteiinikinetiikka stimuloiduissa T-soluissa. Tutkijat odottavat, että T-solustimulaatio tunnistaa erot kahden informatiivisen alaryhmän potilaiden välillä joko TOB1:n tai jonkin pintaproteiinin biomarkkerimme mRNA- tai proteiinikinetiikassa. Toisin sanoen nämä tutkimukset voivat osoittaa eroja aktiivisen ja stabiilin MS-taudin potilaiden välillä.

Tämä strategia sisältää stimulaatiovaiheen ja analyyttisen vaiheen seuraavasti.

1. Ensinnäkin, kun tutkijat ovat valinneet potilaat kahdesta potilasalaryhmästä (3-4 potilasta/alaryhmä) ja ikään vastaavista HC:istä, tutkijat stimuloivat kylmäsäilytettyä PBMC:tä lähtötilanteen ja vuoden hoitonäytteistä käyttämällä PMA/ionomysiiniä ja BD GolgiStop™ -proteiininkuljetuksen estoainetta. 4 tunnin ajan 37 °C:ssa 5 % C02:ssa. Tutkijat määrittävät kunkin reagenssin optimaaliset pitoisuudet määrityskohtaisella titrauksella käytettäväksi PrimeFlow RNA Assay -määrityksen kanssa.
2. Toisessa vaiheessa käytetään PrimeFlow RNA Assay -testiä TOB1:n mRNA- ja proteiinikinetiikkaan sekä potilasalaryhmien ja HC:iden informatiivisimman pintaproteiinin biomarkkerin arvioimiseen. Tämä määritys voi paljastaa sekä RNA:n että proteiinin ilmentymisen dynamiikan yksittäisissä soluissa ja T-alaryhmissä vasteena T-solustimulaatiolle. PrimeFlow RNA -määrityksen käyttökelpoisuus validoitiin T-alaryhmien maamerkkitutkimuksessa (4); yksityiskohtaiset menetelmät ovat saatavilla seuraavalla verkkosivustolla: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Tilastollinen analyysi. Tutkijat käyttävät GraphPad Prism 7:ää kaikissa tilastollisissa analyyseissä ja sopivat parametriset tai ei-parametriset testit tietojen jakautumisen mukaan.

E. ODOTETUT TULOKSET. Ensinnäkin tutkijat odottavat, että yksi tai useampi T-alaryhmä lähtötilanteen PBMC-näytteissä (ennen teriflunomidihoitoa) osoittaa lisääntynyttä yhden tai useamman T-soluaktivaatiomolekyylin pintaproteiiniekspressiota potilailla, joilla on taudin aktiivisuus On-Tx verrattuna potilaisiin, jotka eivät näytä taudin aktiivisuutta On-Tx. Tällainen löydös voi auttaa tunnistamaan potilaita, joille teriflunomidi on optimaalinen DMT. Toiseksi teriflunomidihoito voi muuttaa yhden tai useamman T-soluaktivaatiomolekyylin ilmentymistä yhdessä tai useammassa T-alaryhmässä, ja tämä muutos voi korreloida taudin vähentyneen aktiivisuuden kanssa, mikä viittaa siihen, että muuttunut T-soluaktivaatio myötävaikuttaa positiiviseen vasteeseen teriflunomidille. . Kolmanneksi, lähtötilanteen näytteiden lyhytaikaiset viljelmät vs. yhden vuoden näytteitä potilaista ja iästä vastaavista HC:istä voivat havaita eroja T-soluaktivaatiomarkkerin mRNA- ja proteiinikinetiikassa potilailla lähtötilanteessa, mikä sitten palaa normaaliin malliin jotka eivät ole aktiivisia vuoden aikana. Tällaiset havainnot viittaavat teriflunomidin välittämiin merkittäviin toiminnallisiin muutoksiin, jotka korreloivat positiivisen terapeuttisen vasteen kanssa.

F. TUTKIMUSKOHTEET Kaikki potilaat rekrytoidaan Montrealin neurologisen sairaalan MS Clinicsista ja kaikki kokeellinen työ tehdään Duff Medical Buildingissa, McGill Universityn patologian osastossa.

G. AIKAAJAT G.1. Ensimmäinen potilas (FPI) - kuukausi sopimuksen täytäntöönpanon ja eettisen hyväksynnän jälkeen.

G.2. Last Patient In (LPI) ~ 12–15 kuukautta sopimuksen täytäntöönpanon ja eettisen hyväksynnän jälkeen: tämä kuvastaa aikaa, joka tarvitaan yhteensä enintään 75 Teriflunomidilla hoidetun potilaan värväämiseen.

G.3. Välianalyysit

• Arvioi rekrytointiaste 2 kuukauden kuluttua harkitaksesi satelliittikeskusten sisällyttämistä.
• TOB1:n RT-PCR-analyysi 5-10 potilaalla Pre-TX ja ikäsovitetuilla HC:illä (4 kuukautta).
• Pintaproteiinien biomarkkerien alustava virtaussytometrinen analyysi, joka perustuu ~ 3 aktiivisen vs. ~ 3 vakaan potilaan alustavaan tunnistamiseen 8 kuukauden On-Tx aikapisteessä
• Pintaproteiinien biomarkkerien lisävirtaussytometrinen analyysi 3:lla muulla aktiivisella vs. 3 stabiililla potilaalla, jotka tunnistettiin 14 kuukauden On-Tx-aikapisteessä.

G4. Edistymisraportit. Neljännesvuosittaiset edistymispäivitykset potilaiden rekrytoinnista ja puolivuosittainen raportti kliinisen arvioinnin parametreista alaryhmäpotilaille.

G5. Viimeinen potilaskäynti (LPLV) - 24-27 kuukautta. G6. Loppuraportin valmistuminen - 30 kuukautta. G7. Suunniteltu käsikirjoituksen lähetys. 33 kuukautta. H. LIITTEET LIITE 1. Ensisijainen vasta-ainepaneeli

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (R&D Sys.)
7. TLR2 PE (eBioscience)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBioscience)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (joskus lyhenne). AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ LIITE 2. PrimeFlow™ RNA-määrityspaneelit, mukaan lukien TLR2 mahdollisena biomarkkerina - kehitteillä