Biomarcadores e atividade da doença em pacientes tratados com teriflunomida (Aubagio)

TÍTULO: Associação de possíveis biomarcadores com atividade da doença em pacientes tratados com teriflunomida (Aubagio ®)

A. ANTECEDENTES Teriflunomida (Aubagio) é um DMT imunomodulador oral uma vez ao dia para pacientes com EM remitente-recorrente (EMRR) (1). O objetivo do presente estudo é determinar se uma assinatura putativa de biomarcador prediz a atividade da doença em pacientes tratados com teriflunomida. Os pesquisadores identificaram anteriormente uma assinatura de 130 genes associada à ativação imune que identificou pacientes com EM que tiveram uma transição rápida para EM secundária progressiva (SPMS). A partir desta assinatura, os investigadores identificaram três genes (TLR2, TLR4 e CCR1) que aumentaram a expressão de proteínas em células T CD4 naïve nestes pacientes. Os pesquisadores também mostraram que o mRNA para um fator antiproliferação, denominado TOB1, foi regulado negativamente nessas células T em pacientes com progressão rápida da EM. Os achados sugerem, portanto, que a ativação virgem de células T CD4 identifica pacientes com EM com curta duração de EMRR (2).

Para esta proposta, o investigador principal sugere que várias moléculas envolvidas na ativação de células T também podem servir como biomarcadores úteis para prever as respostas ao tratamento com teriflunomida.

B. OBJETIVOS DO ESTUDO

B1. Objetivo do estudo e objetivos específicos. O objetivo é determinar se os marcadores de ativação de células T previamente identificados irão predizer a atividade da doença em pacientes tratados com teriflunomida.

Os objetivos específicos do estudo são determinar:

1. a proporção de pacientes pré-tratamento (pré-Tx) que têm expressão alterada de um ou mais marcadores candidatos em um ou mais subconjuntos de T;
2. se os níveis de expressão de um ou mais desses marcadores em um subconjunto T mudam no tratamento (On-Tx) com teriflunomida;
3. se as diferenças no mRNA ou na cinética da proteína de um marcador putativo predizem a atividade da doença em pacientes tratados com teriflunomida;
4. se os níveis de expressão de uma ou mais moléculas alvo, Pre-Tx ou On-Tx, se correlacionam com a evidência de atividade da doença após um ano de tratamento.

C. PROJETO DO ESTUDO.

C1. Resumo do projeto. O estudo é um estudo observacional prospectivo de dois anos de pacientes tratados com teriflunomida. Os investigadores irão recrutar até 75 pacientes no início do estudo. Os investigadores estudarão os pacientes no início e nos intervalos On-Tx com teriflunomida para identificar pacientes com doença ativa versus estável, com base em evidências clínicas (recidivas) e radiológicas (novas lesões hiperintensas em T2). Os investigadores estudarão a expressão de biomarcadores em cada subgrupo de pacientes.

C2. Pontos de extremidade primários. A questão central do estudo é se os níveis de expressão de um ou mais biomarcadores putativos (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) diferem entre os pacientes dos dois subgrupos informativos.

C3. Medidas de resultado. Os resultados que irão abordar a questão central do estudo consistem no seguinte:

1. Medidas dos níveis de expressão de proteína de TLR2, TLR4 e CCR1 em subconjuntos de CD4 T por citometria de fluxo.
2. Expressão de mRNA de TOB1 em subconjuntos de CD4 T por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e PrimeFlow RNA Assay.
3. Diferenças na expressão de mRNA ou proteína de marcadores selecionados em culturas de curto prazo entre pacientes dos dois subgrupos informativos.

C4. População sujeita. A população do estudo inclui:

1. pacientes virgens de tratamento com EMRR das clínicas de EM do Hospital Neurológico de Montreal (MNH) antes do tratamento (pré-Tx) com teriflunomida; e
2. pacientes com EMRR que foram previamente tratados com outras terapias modificadoras da doença (DMTs), mas que estão mudando para teriflunomida.

C5. Aprovação da ética: O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Neurociências do MNH/MN. Os dados serão mantidos por 7 anos.

C6. Consentimentos. O Investigador Principal ou seu delegado obterá o consentimento informado

D. PROCEDIMENTOS DO ESTUDO. O estudo investigará uma assinatura de biomarcador em pacientes com EM que estão sendo tratados com teriflunomida por seu neurologista.

D1. Participantes e visitas clínicas. Antes de iniciar o tratamento com teriflunomida, cada paciente passará por uma avaliação clínica, uma ressonância magnética, como parte da prática clínica de rotina, e uma coleta de sangue (ver abaixo). Nos intervalos, os participantes terão uma avaliação clínica e uma segunda avaliação de ressonância magnética para determinar se eles têm doença ativa ou estável. A fim de permitir uma abordagem faseada, os neurologistas se esforçarão para identificar pacientes após seis meses de tratamento que apresentem evidências de doença ativa versus estável, aproximadamente 3 em cada subgrupo. Coletas de sangue serão obtidas de cada um desses pacientes para estudos laboratoriais subsequentes (veja abaixo).

D2. Coleta de amostra. Até 120 ml de sangue venoso periférico serão coletados de cada indivíduo na linha de base e em intervalos, para coletar soro e plasma, obter contagens totais de linfócitos, contagens de CD3, CD4 e CD8 e isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) para imediata análise e também para criopreservação.

D3. Análise laboratorial.

D3.1. Isolamento de células T CD4 naïve e análise quantitativa por RT-PCR da expressão de TOB1. A expressão reduzida de TOB1, um inibidor da proliferação de células T, correlacionou-se com a rápida progressão de CIS para RRMS em um estudo (2) e também se correlacionou no estudo anterior dos investigadores com a rápida progressão de RRMS para SPMS (2). Os investigadores isolarão células T CD4 virgens usando contas MACS (2) e determinarão a expressão de TOB1 por RT-PCR quantitativo em uma pequena coorte de pacientes (5-10 pacientes) e controles saudáveis ​​de mesma idade (HCs).

D3.2. Análise de PBMC criopreservadas.

Estratégia 1. Expressão de proteínas de superfície de TLR2, TLR4 e CCR1 em subconjuntos de CD4 T. Os investigadores analisarão amostras criopreservadas de linha de base e On-Tx para expressão (% de positividade e MFI) de TLR2, TLR4 e CCR1 na memória ingênua, central, memória efetora, memória efetora diferenciada terminalmente e células T reguladoras por citometria de fluxo em um BD LSRFortessa com um sistema de 5 lasers. Os investigadores usarão o software FlowJo para análise. Os investigadores identificarão o biomarcador que é mais informativo, ou seja, mostra a maior diferença nos níveis de expressão entre pacientes nos dois subgrupos informativos na linha de base ou no tratamento.

Estratégia 2. Comparação da expressão de mRNA de TOB1 por qRT-PCR e PrimeFlow RNA Assay. Os pesquisadores desenvolverão o ensaio de RNA PrimeFlow™ (affymetrix Ebioscience) para análise simultânea de mRNA e expressão de proteínas. Inicialmente, os pesquisadores irão comparar a expressão do mRNA do TOB1 com a obtida por qRT-PCR, já que o qRT-PCR é o padrão ouro para a quantificação do mRNA. Os investigadores irão comparar a expressão de mRNA de TOB1 em células T CD4 virgens pelos dois métodos. Se as medições forem comparáveis, os investigadores poderão avaliar simultaneamente a expressão de TOB1 em células T CD4 virgens e a expressão do biomarcador mais informativo em subconjuntos de CD4 T e comparar os níveis de expressão em pacientes dos dois subgrupos informativos, conforme descrito abaixo .

Estratégia 3. mRNA e cinética de proteína de TOB1 e um biomarcador de células T em células T estimuladas. Os pesquisadores antecipam que a estimulação de células T identificará diferenças entre os pacientes dos dois subgrupos informativos em mRNA ou cinética de proteína de TOB1 ou um de nossos biomarcadores de proteína de superfície. Em outras palavras, esses estudos podem mostrar diferenças entre pacientes com EM ativa versus estável.

Esta estratégia envolve uma fase de estimulação e uma fase analítica como segue.

1. Em primeiro lugar, depois de selecionar pacientes dos dois subgrupos de pacientes (3-4 pacientes/subgrupo) e de HCs de mesma idade, os investigadores estimularão PBMC criopreservadas a partir de amostras iniciais e de tratamento de um ano usando PMA/ionomicina e inibidor de Transporte de Proteína BD GolgiStop™ por 4 horas a 37° C em 5% de CO2. Os investigadores determinarão as concentrações ideais de cada reagente por meio de titulação específica do ensaio para uso com o PrimeFlow RNA Assay.
2. A segunda fase usará o PrimeFlow RNA Assay para avaliar mRNA e cinética de proteína de TOB1 e o biomarcador de proteína de superfície mais informativo em subgrupos de pacientes e HCs. Este ensaio pode revelar a dinâmica da expressão de RNA e proteína em células individuais e em subconjuntos T em resposta à estimulação de células T. A utilidade do ensaio PrimeFlow RNA foi validada em um estudo histórico de subconjuntos T (4); métodos detalhados estão disponíveis no seguinte site: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Análise estatística. Os investigadores usarão o GraphPad Prism 7 para todas as análises estatísticas e usarão testes paramétricos ou não paramétricos apropriados de acordo com a distribuição dos dados.

E. RESULTADOS ANTECIPADOS. Em primeiro lugar, os investigadores antecipam que um ou mais subconjuntos T em amostras de PBMC de linha de base (antes do tratamento com teriflunomida) mostrarão expressão de proteína de superfície aumentada de uma ou mais moléculas de ativação de células T nos pacientes que mostram atividade da doença On-Tx versus pacientes que não mostram atividade da doença On-Tx. Tal descoberta pode ajudar a identificar pacientes para os quais a teriflunomida é o DMT ideal. Em segundo lugar, o tratamento com teriflunomida pode alterar a expressão de uma ou mais moléculas de ativação de células T em um ou mais subconjuntos T e essa alteração pode se correlacionar com a redução da atividade da doença, sugerindo assim que a ativação alterada de células T contribui para uma resposta positiva à teriflunomida . Em terceiro lugar, culturas de curto prazo de amostras de linha de base versus amostras de um ano de pacientes e de HCs pareados por idade podem identificar diferenças no mRNA e na cinética da proteína de um marcador de ativação de células T em pacientes na linha de base, que então revertem para um padrão normal em aqueles sem atividade da doença em um ano. Tais achados apontariam para importantes alterações funcionais mediadas pela teriflunomida que se correlacionam com uma resposta terapêutica positiva.

F. LOCAIS DE ESTUDO Todos os pacientes serão recrutados nas Clínicas de MS do Montreal Neurological Hospital e todo o trabalho experimental será realizado no Duff Medical Building, Departamento de Patologia, McGill University.

G. PRAZOS G.1. First Patient In (FPI) - um mês após a assinatura do contrato e aprovação ética.

G.2. Último paciente em (LPI) ~ 12-15 meses após a assinatura do contrato e aprovação ética: isso reflete o tempo necessário para recrutar um total de até 75 pacientes tratados com Teriflunomida.

G.3. Análises provisórias

• Avalie a taxa de recrutamento em 2 meses para considerar a inclusão de centros satélites.
• Análise RT-PCR de TOB1 em 5-10 pacientes pré-TX e HCs pareados por idade (4 meses).
• Análise preliminar de citometria de fluxo de biomarcadores de proteínas de superfície com base na identificação provisória de ~ 3 pacientes ativos vs. ~ 3 estáveis ​​identificados no ponto de tempo On-Tx de 8 meses
• Análise de citometria de fluxo adicional de biomarcadores de proteínas de superfície em mais 3 pacientes ativos versus 3 pacientes estáveis ​​identificados no ponto de tempo On-Tx de 14 meses.

G4. Relatórios de Progresso. Atualizações trimestrais de progresso no recrutamento de pacientes e relatório semestral sobre parâmetros de avaliação clínica para pacientes de subgrupo.

G5. Última visita do paciente (LPLV) - 24-27 meses. G6. Conclusão do Relatório Final - 30 meses. G7. Submissão de manuscritos projetados. 33 meses. H. APÊNDICES APÊNDICE 1. Painel Primário de Anticorpos

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (R&D Sys.)
7. TLR2 PE (eBiociência)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBiociência)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (às vezes abrev. AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ APÊNDICE 2. Painéis de ensaio de RNA PrimeFlow™ incluindo TLR2 como possível biomarcador - em desenvolvimento