Biomarkører og sygdomsaktivitet hos patienter behandlet med Teriflunomid (Aubagio)

TITEL: Sammenslutning af mulige biomarkører med sygdomsaktivitet hos patienter behandlet med teriflunomid (Aubagio ®)

A. BAGGRUND Teriflunomid (Aubagio) er en oral immunmodulerende DMT én gang dagligt til patienter med recidiverende-remitterende MS (RRMS) (1). Formålet med denne undersøgelse er at bestemme, om en formodet biomarkørsignatur forudsiger sygdomsaktivitet hos patienter behandlet med teriflunomid. Efterforskerne har tidligere identificeret en 130-gen-signatur forbundet med immunaktivering, der identificerede patienter med MS, der havde hurtig overgang til sekundær progressiv MS (SPMS). Ud fra denne signatur identificerede efterforskerne tre gener (TLR2, TLR4 og CCR1), som havde øget proteinekspression på naive CD4 T-celler hos disse patienter. Efterforskerne viste også, at mRNA for en anti-proliferationsfaktor, kaldet TOB1, blev nedreguleret i disse T-celler hos patienter med hurtig MS-progression. Resultaterne tyder derfor på, at naiv CD4 T-celleaktivering identificerer patienter med MS med en kort RRMS-varighed (2).

For dette forslag foreslår hovedforskeren, at forskellige molekyler involveret i T-celleaktivering også kan tjene som nyttige biomarkører til at forudsige behandlingsreaktioner på teriflunomid.

B. STUDIEMÅL

B1. Studiemål og specifikke mål. Målet er at bestemme, om de tidligere identificerede T-celleaktiveringsmarkører vil forudsige sygdomsaktivitet hos patienter behandlet med teriflunomid.

De specifikke undersøgelses formål er at fastslå:

1. andelen af ​​patienter før-behandling (præ-Tx), som har ændret ekspression af en eller flere kandidatmarkører i en eller flere T-undersæt;
2. om ekspressionsniveauer af en eller flere af disse markører i en T-undergruppe ændres ved behandling (On-Tx) med teriflunomid;
3. om forskelle i mRNA eller proteinkinetikken af ​​en formodet markør forudsiger sygdomsaktivitet hos patienter behandlet med teriflunomid;
4. om ekspressionsniveauer af et eller flere målmolekyler, Pre-Tx eller On-Tx, korrelerer med tegn på sygdomsaktivitet efter et års behandling.

C. STUDIEDESIGN.

C1. Design oversigt. Studiet er et toårigt prospektivt observationsstudie af patienter behandlet med teriflunomid. Efterforskerne vil rekruttere op til 75 patienter ved baseline. Efterforskerne vil studere patienter ved baseline og med intervaller On-Tx med teriflunomid for at identificere patienter med aktiv vs. stabil sygdom, baseret på klinisk (tilbagefald) og radiologisk (nye T2 hyperintense læsioner) evidens. Efterforskerne vil studere ekspressionen af ​​biomarkører i hver patientundergruppe.

C2. Primære endepunkter. Det centrale spørgsmål i undersøgelsen er, om ekspressionsniveauerne af en eller flere formodede biomarkører (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) adskiller sig fra patienter fra de to informative undergrupper.

C3. Resultatmål. Resultaterne, der vil behandle undersøgelsens centrale spørgsmål, består af følgende:

1. Målinger af proteinekspressionsniveauer af TLR2, TLR4 og CCR1 på CD4 T-undersæt ved flowcytometri.
2. TOB1-mRNA-ekspression i CD4 T-undersæt ved kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) og PrimeFlow RNA-assay.
3. Forskelle i mRNA eller proteinekspression af udvalgte markører i korttidskulturer mellem patienter fra de to informative undergrupper.

C4. Emnepopulation. Undersøgelsespopulationen omfatter:

1. behandlingsnaive patienter med RRMS fra Montreal Neurological Hospital (MNH) MS-klinikker før behandling (pre-Tx) med teriflunomid; og
2. patienter med RRMS, der tidligere er blevet behandlet med andre sygdomsmodificerende terapier (DMT'er), men som skifter til teriflunomid.

C5. Etisk godkendelse: Undersøgelsen blev godkendt af Neurosciences Research Ethics Board i MNH/MN. Data opbevares i 7 år.

C6. Samtykke. Principal Investigator eller dennes delegerede vil indhente informeret samtykke

D. STUDIEPROCEDURER. Studiet vil undersøge en biomarkørsignatur hos patienter med MS, som er i behandling med teriflunomid af deres neurolog.

D1. Deltagere og klinikbesøg. Før behandlingen med teriflunomid påbegyndes, vil hver patient have en klinisk evaluering, en MR-scanning som en del af rutinemæssig klinisk praksis og en blodprøvetagning (se nedenfor). Med mellemrum vil deltagerne have en klinisk evaluering og en anden MR-evaluering for at afgøre, om de har aktiv vs. stabil sygdom. For at muliggøre en trinvis tilgang, vil neurologerne bestræbe sig på at identificere patienter efter seks måneders behandling, som viser tegn på aktiv vs. stabil sygdom, ca. 3 i hver undergruppe. Der vil blive taget blodprøver fra hver af disse patienter til efterfølgende laboratorieundersøgelser (se nedenfor).

D2. Samling af prøver. Op til 120 ml perifert venøst ​​blod vil blive udtaget fra hvert individ ved baseline og med intervaller, for at opsamle serum og plasma, for at opnå totale lymfocyttal, CD3, CD4 og CD8 tællinger og for at isolere perifere mononukleære blodceller (PBMC) til øjeblikkelig analyse og også til kryokonservering.

D3. Laboratorieanalyse.

D3.1. Naiv CD4 T-celle isolering og kvantitativ RT-PCR analyse af TOB1 ekspression. Reduceret ekspression af TOB1, en inhibitor af T-celleproliferation, korrelerede med hurtig progression fra CIS til RRMS i en undersøgelse (2), og korrelerede også i efterforskernes tidligere undersøgelse med hurtig progression fra RRMS til SPMS (2). Efterforskerne vil isolere naive CD4 T-celler ved hjælp af MACS-perler (2) og bestemme TOB1-ekspression ved kvantitativ RT-PCR i en lille kohorte af patienter (5-10 patienter) og aldersmatchede sunde kontroller (HC'er).

D3.2. Analyse af kryokonserveret PBMC.

Strategi 1. Overfladeproteinekspression af TLR2, TLR4 og CCR1 i CD4 T-undersæt. Efterforskerne vil analysere baseline og On-Tx kryokonserverede prøver for ekspression (% positivitet og MFI) af TLR2, TLR4 og CCR1 på naiv, central hukommelse, effektorhukommelse, terminalt differentieret effektorhukommelse og regulatoriske T-celler ved flowcytometri på en BD LSRFortessa med et 5-laser system. Efterforskerne vil bruge FlowJo-software til analyse. Efterforskerne vil identificere den biomarkør, der er mest informativ, dvs. viser den største forskel i ekspressionsniveauer mellem patienter i de to informative undergrupper ved baseline eller under behandling.

Strategi 2. Sammenligning af TOB1-mRNA-ekspression ved qRT-PCR og PrimeFlow RNA-analysen. Efterforskerne vil udvikle PrimeFlow™ RNA-assayet (affymetrix Ebioscience) til samtidig analyse af mRNA og proteinekspression. Indledningsvis vil efterforskerne sammenligne TOB1-mRNA-ekspression med den, der opnås ved qRT-PCR, da qRT-PCR er guldstandarden for mRNA-kvantificering. Forskerne vil sammenligne TOB1 mRNA-ekspression i naive CD4 T-celler ved de to metoder. Hvis målingerne er sammenlignelige, vil efterforskerne samtidigt være i stand til at vurdere TOB1-ekspression i naive CD4 T-celler og ekspressionen af ​​den mest informative biomarkør i CD4 T-undergrupper og sammenligne ekspressionsniveauer hos patienter fra de to informative undergrupper som skitseret nedenfor. .

Strategi 3. mRNA og proteinkinetik af TOB1 og en T-celle biomarkør i stimulerede T-celler. Forskerne forventer, at T-cellestimulering vil identificere forskelle mellem patienter fra de to informative undergrupper i enten mRNA eller proteinkinetik af TOB1 eller en af ​​vores overfladeproteinbiomarkører. Med andre ord kan disse undersøgelser vise forskelle mellem patienter med aktiv versus stabil MS.

Denne strategi involverer en stimuleringsfase og en analytisk fase som følger.

1. For det første, efter at have udvalgt patienter fra de to patientundergrupper (3-4 patienter/undergruppe) og fra aldersmatchede HC'er, vil efterforskerne stimulere kryokonserveret PBMC fra baseline og et-års behandlingsprøver ved hjælp af PMA/ionomycin og BD GolgiStop™ Protein Transport-hæmmer i 4 timer ved 37°C i 5% CO2. Efterforskerne vil bestemme de optimale koncentrationer af hvert reagens gennem assayspecifik titrering til brug med PrimeFlow RNA-analysen.
2. Den anden fase vil bruge PrimeFlow RNA-analysen til at vurdere mRNA- og proteinkinetikken af ​​TOB1 og den mest informative overfladeproteinbiomarkør i patientundergrupper og HC'er. Denne analyse kan afsløre dynamikken i både RNA- og proteinekspression i individuelle celler og i T-undersæt som reaktion på T-celle-stimulering. Nytten af ​​PrimeFlow RNA-analysen blev valideret i et skelsættende studie af T-undersæt (4); detaljerede metoder er tilgængelige på følgende websted: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Statistisk analyse. Efterforskerne vil bruge GraphPad Prism 7 til alle statistiske analyser og bruge passende parametriske eller ikke-parametriske test i henhold til datafordelingen.

E. FORVENTEDE RESULTATER. For det første forudser efterforskerne, at en eller flere T-undersæt i baseline-PBMC-prøver (før teriflunomidbehandling) vil vise øget overfladeproteinekspression af et eller flere T-celleaktiveringsmolekyler hos de patienter, der viser sygdomsaktivitet On-Tx vs. viser ikke sygdomsaktivitet On-Tx. Et sådant fund kan hjælpe med at identificere patienter, for hvem teriflunomid er den optimale DMT. For det andet kan behandling med teriflunomid ændre ekspressionen af ​​et eller flere T-celleaktiveringsmolekyler i en eller flere T-undergrupper, og denne ændring kan korrelere med reduceret sygdomsaktivitet, hvilket tyder på, at ændret T-celleaktivering bidrager til en positiv respons på teriflunomid . For det tredje kan korttidskulturer af basislinjeprøver vs. etårige prøver fra patienter og fra aldersmatchede HC'er identificere forskelle i mRNA og proteinkinetik af en T-celleaktiveringsmarkør hos patienter ved baseline, som derefter vender tilbage til et normalt mønster i dem uden sygdomsaktivitet efter et år. Sådanne fund peger i retning af vigtige funktionelle ændringer medieret af teriflunomid, som korrelerer med et positivt terapeutisk respons.

F. STUDIESTEDER Alle patienter vil blive rekrutteret fra Montreal Neurological Hospital MS Clinics, og alt eksperimentelt arbejde vil blive udført i Duff Medical Building, Department of Pathology, McGill University.

G. TIDSLINJER G.1. First Patient In (FPI) - en måned efter kontraktens udførelse og etikgodkendelse.

G.2. Last Patient In (LPI) ~ 12-15 måneder efter udførelse af kontrakten og godkendelse af etik: dette afspejler den tid, der kræves for at rekruttere i alt op til 75 patienter behandlet med Teriflunomide.

G.3. Midlertidige analyser

• Vurder rekrutteringsraten efter 2 måneder for at overveje inklusion af satellitcentre.
• RT-PCR-analyse af TOB1 hos 5-10 patienter Pre-TX og aldersmatchede HC'er (4 måneder).
• Foreløbig flowcytometrianalyse af overfladeproteinbiomarkører baseret på den foreløbige identifikation af ~ 3 aktive vs. ~ 3 stabile patienter identificeret ved 8-måneders On-Tx-tidspunktet
• Yderligere flowcytometrianalyse af overfladeproteinbiomarkører på yderligere 3 aktive vs. 3 stabile patienter identificeret på 14 måneders On-Tx tidspunkt.

G4. Fremskridtsrapporter. Kvartalsvise fremskridtsopdateringer om patientrekruttering og halvårlig rapport om kliniske evalueringsparametre til undergruppepatienter.

G5. Sidste patientbesøg (LPLV) - 24-27 måneder. G6. Afslutning af slutrapport - 30 måneder. G7. Forventet manuskriptaflevering. 33 måneder. H. BILAG BILAG 1. Primært antistofpanel

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (R&D System)
7. TLR2 PE (eBioscience)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBioscience)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (nogle gange forkortet. AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ APPENDIKS 2. PrimeFlow™ RNA-analysepaneler inklusive TLR2 som en mulig biomarkør - under udvikling