Biomarcatori e attività della malattia nei pazienti trattati con teriflunomide (Aubagio)

TITOLO: Associazione di possibili biomarcatori con attività della malattia in pazienti trattati con teriflunomide (Aubagio ®)

A. BACKGROUND Teriflunomide (Aubagio) è un DMT immunomodulatore orale somministrato una volta al giorno per i pazienti con SM recidivante-remittente (RRMS) (1). L'obiettivo del presente studio è determinare se una presunta firma di biomarcatore predice l'attività della malattia nei pazienti trattati con teriflunomide. I ricercatori hanno precedentemente identificato una firma di 130 geni associata all'attivazione immunitaria che identificava i pazienti con SM che avevano avuto una rapida transizione verso la SM secondariamente progressiva (SPMS). Da questa firma, i ricercatori hanno identificato tre geni (TLR2, TLR4 e CCR1) che avevano una maggiore espressione proteica sulle cellule T CD4 naïve in questi pazienti. I ricercatori hanno anche dimostrato che l'mRNA per un fattore anti-proliferazione, chiamato TOB1, era sottoregolato in queste cellule T in pazienti con rapida progressione della SM. I risultati suggeriscono, quindi, che l'attivazione naïve delle cellule T CD4 identifichi i pazienti con SM con una breve durata della SMRR (2).

Per questa proposta, il ricercatore principale suggerisce che varie molecole coinvolte nell'attivazione delle cellule T possono anche fungere da utili biomarcatori per prevedere le risposte terapeutiche alla teriflunomide.

B. OBIETTIVI DI STUDIO

B1. Obiettivo dello studio e scopi specifici. L'obiettivo è determinare se i marcatori di attivazione delle cellule T che sono stati precedentemente identificati predicono l'attività della malattia nei pazienti trattati con teriflunomide.

Gli obiettivi specifici dello studio sono determinare:

1. la percentuale di pazienti prima del trattamento (pre-Tx) che hanno alterato l'espressione di uno o più marcatori candidati in uno o più sottoinsiemi T;
2. se i livelli di espressione di uno o più di questi marcatori in un sottogruppo T cambiano/i durante il trattamento (On-Tx) con teriflunomide;
3. se le differenze nell'mRNA o nella cinetica proteica di un marcatore putativo predice l'attività della malattia nei pazienti trattati con teriflunomide;
4. se i livelli di espressione di una o più molecole bersaglio, Pre-Tx o On-Tx, correlano con l'evidenza dell'attività della malattia dopo un anno di trattamento.

C. PROGETTAZIONE DI STUDIO.

C1. Riepilogo del progetto. Lo studio è uno studio osservazionale prospettico di due anni su pazienti trattati con teriflunomide. Gli investigatori recluteranno fino a 75 pazienti al basale. Gli investigatori studieranno i pazienti al basale e ad intervalli On-Tx con teriflunomide al fine di identificare i pazienti con malattia attiva vs. stabile, sulla base di prove cliniche (recidive) e radiologiche (nuove lesioni iperintense T2). Gli investigatori studieranno l'espressione dei biomarcatori in ciascun sottogruppo di pazienti.

C2. Endpoint primari. La questione centrale dello studio è se i livelli di espressione di uno o più biomarcatori putativi (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) differiscono tra i pazienti dei due sottogruppi informativi.

C3. Misure di risultato. I risultati che affronteranno la questione centrale dello studio sono i seguenti:

1. Misure dei livelli di espressione proteica di TLR2, TLR4 e CCR1 su sottoinsiemi T CD4 mediante citometria a flusso.
2. Espressione dell'mRNA TOB1 nei sottoinsiemi T CD4 mediante RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) e PrimeFlow RNA Assay.
3. Differenze nell'espressione di mRNA o proteine ​​di marcatori selezionati in colture a breve termine tra pazienti dei due sottogruppi informativi.

C4. Popolazione soggetto. La popolazione in studio comprende:

1. pazienti naive al trattamento con RRMS dalle cliniche MS del Montreal Neurological Hospital (MNH) prima del trattamento (pre-Tx) con teriflunomide; E
2. pazienti con SMRR precedentemente trattati con altre terapie modificanti la malattia (DMT) ma che stanno passando a teriflunomide.

C5. Approvazione etica: lo studio è stato approvato dal Neurosciences Research Ethics Board del MNH/MN. I dati saranno conservati per 7 anni.

C6. Consensi. Il Principal Investigator o un suo delegato otterrà il consenso informato

D. PROCEDURE DI STUDIO. Lo studio indagherà sulla firma di un biomarcatore in pazienti con SM che vengono trattati con teriflunomide dal loro neurologo.

D1. Partecipanti e visite cliniche. Prima di iniziare il trattamento con teriflunomide, ogni paziente sarà sottoposto a una valutazione clinica, una risonanza magnetica, come parte della pratica clinica di routine, e un prelievo di sangue (vedi sotto). A intervalli, i partecipanti avranno una valutazione clinica e una seconda valutazione MRI per determinare se hanno una malattia attiva o stabile. Al fine di consentire un approccio graduale, i neurologi cercheranno di identificare i pazienti dopo sei mesi di trattamento che mostrano evidenza di malattia attiva rispetto a malattia stabile, circa 3 in ciascun sottogruppo. I prelievi di sangue saranno ottenuti da ciascuno di questi pazienti per i successivi studi di laboratorio (vedi sotto).

D2. Raccolta campioni. Saranno prelevati fino a 120 ml di sangue venoso periferico da ciascun soggetto al basale e ad intervalli, per raccogliere siero e plasma, per ottenere la conta totale dei linfociti, CD3, CD4 e CD8 e per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per l'immediato analisi e anche per la crioconservazione.

D3. Analisi di laboratorio.

D3.1. Isolamento ingenuo delle cellule T CD4 e analisi quantitativa RT-PCR dell'espressione di TOB1. Espressione ridotta di TOB1, un inibitore della proliferazione delle cellule T, correlata con la rapida progressione da CIS a RRMS in uno studio (2), e correlata anche nel precedente studio dei ricercatori con rapida progressione da RRMS a SPMS (2). I ricercatori isoleranno le cellule T CD4 naïve utilizzando microsfere MACS (2) e determineranno l'espressione di TOB1 mediante RT-PCR quantitativa in una piccola coorte di pazienti (5-10 pazienti) e controlli sani di pari età (HC).

D3.2. Analisi di PBMC criopreservate.

Strategia 1. Espressione proteica di superficie di TLR2, TLR4 e CCR1 in sottoinsiemi T di CD4. Gli investigatori analizzeranno i campioni crioconservati al basale e On-Tx per l'espressione (% di positività e MFI) di TLR2, TLR4 e CCR1 su naïve, memoria centrale, memoria effettrice, memoria effettrice differenziata terminale e cellule T regolatorie mediante citometria a flusso su un BD LSRFortessa con un sistema a 5 laser. Gli investigatori utilizzeranno il software FlowJo per l'analisi. Gli investigatori identificheranno il biomarcatore che è più informativo, ovvero mostra la maggiore differenza nei livelli di espressione tra i pazienti nei due sottogruppi informativi al basale o durante il trattamento.

Strategia 2. Confronto dell'espressione dell'mRNA di TOB1 mediante qRT-PCR e PrimeFlow RNA Assay. I ricercatori svilupperanno il test PrimeFlow ™ RNA (affymetrix Ebioscience) per l'analisi simultanea dell'mRNA e dell'espressione proteica. Inizialmente, i ricercatori confronteranno l'espressione dell'mRNA di TOB1 con quella ottenuta da qRT-PCR, poiché qRT-PCR è il gold standard per la quantificazione dell'mRNA. Gli investigatori confronteranno l'espressione dell'mRNA TOB1 nelle cellule T CD4 naïve con i due metodi. Se le misurazioni sono comparabili, i ricercatori saranno quindi in grado di valutare simultaneamente l'espressione di TOB1 nelle cellule T CD4 naïve e l'espressione del biomarcatore più informativo nei sottogruppi T CD4 e confrontare i livelli di espressione nei pazienti dei due sottogruppi informativi come descritto di seguito .

Strategia 3. MRNA e cinetica proteica di TOB1 e un biomarcatore di cellule T in cellule T stimolate. I ricercatori prevedono che la stimolazione delle cellule T identificherà le differenze tra i pazienti dei due sottogruppi informativi nell'mRNA o nella cinetica proteica di TOB1 o in uno dei nostri biomarcatori proteici di superficie. In altre parole, questi studi possono mostrare differenze tra pazienti con SM attiva e stabile.

Questa strategia prevede una fase di stimolazione e una fase analitica come segue.

1. In primo luogo, dopo aver selezionato i pazienti dai due sottogruppi di pazienti (3-4 pazienti/sottogruppo) e da HC di pari età, i ricercatori stimoleranno le PBMC criopreservate dai campioni di trattamento al basale e di un anno utilizzando PMA/ionomicina e l'inibitore del trasporto proteico BD GolgiStop™ per 4 ore a 37° C in 5% CO2. I ricercatori determineranno le concentrazioni ottimali di ciascun reagente attraverso la titolazione specifica del test per l'uso con il test PrimeFlow RNA.
2. La seconda fase utilizzerà il PrimeFlow RNA Assay per valutare la cinetica dell'mRNA e della proteina di TOB1 e il biomarcatore proteico di superficie più informativo nei sottogruppi di pazienti e negli HC. Questo test può rivelare la dinamica dell'espressione sia dell'RNA che della proteina nelle singole cellule e nei sottoinsiemi T in risposta alla stimolazione delle cellule T. L'utilità del test PrimeFlow RNA è stata convalidata in uno studio fondamentale sui sottoinsiemi T (4); metodi dettagliati sono disponibili sul seguente sito web: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Analisi statistica. Gli investigatori utilizzeranno GraphPad Prism 7 per tutte le analisi statistiche e utilizzeranno test parametrici o non parametrici appropriati in base alla distribuzione dei dati.

E. RISULTATI PREVISTI. In primo luogo, i ricercatori prevedono che uno o più sottoinsiemi T nei campioni di PBMC al basale (prima del trattamento con teriflunomide) mostreranno una maggiore espressione proteica di superficie di una o più molecole di attivazione delle cellule T nei pazienti che mostrano attività di malattia On-Tx rispetto ai pazienti che non mostrano l'attività della malattia On-Tx. Tale scoperta può aiutare a identificare i pazienti per i quali la teriflunomide è il DMT ottimale. In secondo luogo, il trattamento con teriflunomide può alterare l'espressione di una o più molecole di attivazione delle cellule T in uno o più sottogruppi T e questa alterazione può essere correlata alla ridotta attività della malattia, suggerendo quindi che l'attivazione alterata delle cellule T contribuisce a una risposta positiva alla teriflunomide . In terzo luogo, colture a breve termine di campioni al basale rispetto a campioni di un anno da pazienti e da HC della stessa età possono identificare differenze nell'mRNA e nella cinetica proteica di un marcatore di attivazione delle cellule T nei pazienti al basale, che poi ritornano a un modello normale in quelli senza attività di malattia a un anno. Tali risultati indicherebbero importanti alterazioni funzionali mediate dalla teriflunomide che si correlano con una risposta terapeutica positiva.

F. SITI DI STUDIO Tutti i pazienti saranno reclutati dalle cliniche MS dell'ospedale neurologico di Montreal e tutto il lavoro sperimentale sarà svolto nel Duff Medical Building, Dipartimento di Patologia, McGill University.

G. TEMPI G.1. First Patient In (FPI) - un mese dopo l'esecuzione del contratto e l'approvazione etica.

G.2. Last Patient In (LPI) ~ 12-15 mesi dopo l'esecuzione del contratto e l'approvazione etica: questo riflette il tempo necessario per reclutare un totale di fino a 75 pazienti trattati con Teriflunomide.

G.3. Analisi provvisorie

• Valutare il tasso di reclutamento a 2 mesi per considerare l'inclusione dei centri satellite.
• Analisi RT-PCR di TOB1 in 5-10 pazienti Pre-TX e HC di pari età (4 mesi).
• Analisi preliminare della citometria a flusso dei biomarcatori proteici di superficie basata sull'identificazione provvisoria di ~ 3 pazienti attivi rispetto a ~ 3 pazienti stabili identificati al punto temporale On-Tx di 8 mesi
• Ulteriore analisi della citometria a flusso dei biomarcatori proteici di superficie su altri 3 pazienti attivi rispetto a 3 pazienti stabili identificati al punto temporale On-Tx di 14 mesi.

G4. Rapporti sullo stato di avanzamento. Aggiornamenti trimestrali sullo stato di avanzamento del reclutamento dei pazienti e rapporto semestrale sui parametri di valutazione clinica per sottogruppi di pazienti.

G5. Ultima visita del paziente (LPLV) - 24-27 mesi. G6. Completamento della relazione finale - 30 mesi. G7. Invio previsto del manoscritto. 33 mesi. H. APPENDICI APPENDICE 1. Pannello di anticorpi primari

1. FVS510 (BD)
2. CD4 BUV395 (CD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (CD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (R&D Sys.)
7. TLR2 PE (eBioscienza)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBioscienza)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (a volte abbreviato. AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ APPENDICE 2. PrimeFlow™ RNA Assay Panels incluso TLR2 come possibile biomarcatore - in fase di sviluppo