Biomarcadores y actividad de la enfermedad en pacientes tratados con teriflunomida (Aubagio)

TÍTULO: Asociación de posibles biomarcadores con actividad de la enfermedad en pacientes tratados con teriflunomida (Aubagio ®)

A. ANTECEDENTES La teriflunomida (Aubagio) es un DMT inmunomodulador oral que se administra una vez al día para pacientes con EM remitente-recurrente (EMRR) (1). El objetivo del presente estudio es determinar si una supuesta firma biomarcadora predice la actividad de la enfermedad en pacientes tratados con teriflunomida. Los investigadores identificaron previamente una firma de 130 genes asociada con la activación inmunitaria que identificó a los pacientes con EM que tenían una transición rápida a la EM progresiva secundaria (EMSP). A partir de esta firma, los investigadores identificaron tres genes (TLR2, TLR4 y CCR1) que habían aumentado la expresión de proteínas en las células T CD4 vírgenes en estos pacientes. Los investigadores también demostraron que el ARNm de un factor antiproliferación, denominado TOB1, estaba regulado a la baja en estas células T en pacientes con progresión rápida de la EM. Los hallazgos sugieren, por lo tanto, que la activación ingenua de células T CD4 identifica a los pacientes con EM que tienen una EMRR de corta duración (2).

Para esta propuesta, el investigador principal sugiere que varias moléculas involucradas en la activación de las células T también pueden servir como biomarcadores útiles para predecir las respuestas al tratamiento con teriflunomida.

B. OBJETIVOS DEL ESTUDIO

B1. Estudio objetivo y fines específicos. El objetivo es determinar si los marcadores de activación de células T previamente identificados predecirán la actividad de la enfermedad en pacientes tratados con teriflunomida.

Los objetivos específicos del estudio son determinar:

1. la proporción de pacientes antes del tratamiento (pre-Tx) que tienen expresión alterada de uno o más marcadores candidatos en uno o más subconjuntos T;
2. si los niveles de expresión de uno o más de estos marcadores en un subconjunto T cambian durante el tratamiento (On-Tx) con teriflunomida;
3. si las diferencias en la cinética del ARNm o de la proteína de un marcador putativo predicen la actividad de la enfermedad en pacientes tratados con teriflunomida;
4. si los niveles de expresión de una o más moléculas diana, Pre-Tx o On-Tx, se correlacionan con la evidencia de actividad de la enfermedad después de un año de tratamiento.

C. DISEÑO DEL ESTUDIO.

C1. Resumen de diseño. El estudio es un estudio observacional prospectivo de dos años de duración de pacientes tratados con teriflunomida. Los investigadores reclutarán hasta 75 pacientes al inicio del estudio. Los investigadores estudiarán a los pacientes al inicio y en intervalos On-Tx con teriflunomida para identificar a los pacientes con enfermedad activa frente a estable, en función de la evidencia clínica (recaída) y radiológica (nuevas lesiones hiperintensas en T2). Los investigadores estudiarán la expresión de biomarcadores en cada subgrupo de pacientes.

C2. Puntos finales primarios. La pregunta central del estudio es si los niveles de expresión de uno o más biomarcadores putativos (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) difieren entre los pacientes de los dos subgrupos informativos.

C3. Medidas de resultado. Los resultados que abordarán la pregunta central del estudio son los siguientes:

1. Medidas de los niveles de expresión de proteínas de TLR2, TLR4 y CCR1 en subconjuntos T de CD4 mediante citometría de flujo.
2. Expresión de ARNm de TOB1 en subconjuntos T de CD4 mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) y el ensayo de ARN PrimeFlow.
3. Diferencias en la expresión de ARNm o proteínas de marcadores seleccionados en cultivos a corto plazo entre pacientes de los dos subgrupos informativos.

C4. Población sujeta. La población de estudio incluye:

1. pacientes sin tratamiento previo con EMRR de las clínicas de EM del Hospital Neurológico de Montreal (MNH) antes del tratamiento (pre-Tx) con teriflunomida; y
2. pacientes con EMRR que fueron tratados previamente con otras terapias modificadoras de la enfermedad (TME) pero que están cambiando a teriflunomida.

C5. Aprobación ética: El estudio fue aprobado por el Consejo de Ética en Investigación en Neurociencias del MNH/MN. Los datos se conservarán durante 7 años.

C6. consentimientos El Investigador Principal o su delegado obtendrá el consentimiento informado

D. PROCEDIMIENTOS DE ESTUDIO. El estudio investigará la firma de un biomarcador en pacientes con EM que están siendo tratados con teriflunomida por su neurólogo.

D1. Participantes y visitas a la clínica. Antes de comenzar el tratamiento con teriflunomida, cada paciente se someterá a una evaluación clínica, una resonancia magnética, como parte de la práctica clínica habitual, y una extracción de sangre (ver más abajo). A intervalos, los participantes tendrán una evaluación clínica y una segunda evaluación de resonancia magnética para determinar si tienen una enfermedad activa o estable. Para permitir un enfoque por etapas, los neurólogos se esforzarán por identificar a los pacientes después de seis meses de tratamiento que muestren evidencia de enfermedad activa versus estable, aproximadamente 3 en cada subgrupo. Se obtendrán extracciones de sangre de cada uno de estos pacientes para estudios de laboratorio posteriores (ver más abajo).

D2. Coleccion de muestra. Se extraerán hasta 120 ml de sangre venosa periférica de cada sujeto al inicio y a intervalos, para recolectar suero y plasma, obtener recuentos de linfocitos totales, recuentos de CD3, CD4 y CD8 y aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para su análisis inmediato. análisis y también para la crioconservación.

D3. Análisis de laboratorio.

D3.1. Aislamiento de células T CD4 ingenuas y análisis cuantitativo de RT-PCR de la expresión de TOB1. La expresión reducida de TOB1, un inhibidor de la proliferación de células T, se correlacionó con una progresión rápida de CIS a EMRR en un estudio (2), y también se correlacionó en el estudio anterior de los investigadores con una progresión rápida de EMRR a EMSP (2). Los investigadores aislarán las células T CD4 vírgenes utilizando perlas MACS (2) y determinarán la expresión de TOB1 mediante RT-PCR cuantitativa en una pequeña cohorte de pacientes (5-10 pacientes) y controles sanos (HC) de la misma edad.

D3.2. Análisis de PBMC crioconservadas.

Estrategia 1. Expresión de proteínas de superficie de TLR2, TLR4 y CCR1 en subconjuntos T de CD4. Los investigadores analizarán las muestras crioconservadas de referencia y On-Tx para la expresión (% de positividad y MFI) de TLR2, TLR4 y CCR1 en memoria central, memoria efectora, memoria efectora terminalmente diferenciada y células T reguladoras mediante citometría de flujo en un BD LSRFortessa con un sistema de 5 láseres. Los investigadores utilizarán el software FlowJo para el análisis. Los investigadores identificarán el biomarcador que sea más informativo, es decir, que muestre la mayor diferencia en los niveles de expresión entre los pacientes de los dos subgrupos informativos al inicio del estudio o durante el tratamiento.

Estrategia 2. Comparación de la expresión de ARNm de TOB1 mediante qRT-PCR y el ensayo de ARN PrimeFlow. Los investigadores desarrollarán el ensayo de ARN PrimeFlow™ (affymetrix Ebioscience) para el análisis simultáneo de ARNm y expresión de proteínas. Inicialmente, los investigadores compararán la expresión de ARNm de TOB1 con la obtenida por qRT-PCR, ya que qRT-PCR es el estándar de oro para la cuantificación de ARNm. Los investigadores compararán la expresión del ARNm de TOB1 en células T CD4 vírgenes mediante los dos métodos. Si las mediciones son comparables, los investigadores podrán evaluar simultáneamente la expresión de TOB1 en células T CD4 vírgenes y la expresión del biomarcador más informativo en los subconjuntos T de CD4 y comparar los niveles de expresión en pacientes de los dos subgrupos informativos, como se describe a continuación. .

Estrategia 3. Cinética de ARNm y proteína de TOB1 y un biomarcador de células T en células T estimuladas. Los investigadores anticipan que la estimulación de células T identificará diferencias entre los pacientes de los dos subgrupos informativos en la cinética de ARNm o proteína de TOB1 o uno de nuestros biomarcadores de proteína de superficie. En otras palabras, estos estudios pueden mostrar diferencias entre pacientes con EM activa y estable.

Esta estrategia implica una fase de estimulación y una fase analítica de la siguiente manera.

1. En primer lugar, después de seleccionar pacientes de los dos subgrupos de pacientes (3-4 pacientes/subgrupo) y de HC de la misma edad, los investigadores estimularán PBMC crioconservadas a partir de muestras de tratamiento iniciales y de un año utilizando PMA/ionomicina y el inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™. durante 4 h a 37 °C en CO2 al 5 %. Los investigadores determinarán las concentraciones óptimas de cada reactivo a través de la titulación específica del ensayo para su uso con el ensayo de ARN PrimeFlow.
2. La segunda fase utilizará el ensayo de ARN PrimeFlow para evaluar la cinética de ARNm y proteína de TOB1 y el biomarcador de proteína de superficie más informativo en subgrupos de pacientes y HC. Este ensayo puede revelar la dinámica de la expresión tanto del ARN como de la proteína en células individuales y en subconjuntos T en respuesta a la estimulación de células T. La utilidad del ensayo PrimeFlow RNA se validó en un estudio histórico de subconjuntos T (4); los métodos detallados están disponibles en el siguiente sitio web: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Análisis estadístico. Los investigadores utilizarán GraphPad Prism 7 para todos los análisis estadísticos y utilizarán pruebas paramétricas o no paramétricas adecuadas según la distribución de datos.

E. RESULTADOS ESPERADOS. En primer lugar, los investigadores anticipan que uno o más subconjuntos T en las muestras de PBMC de referencia (antes del tratamiento con teriflunomida) mostrarán una mayor expresión de proteína de superficie de una o más moléculas de activación de células T en los pacientes que muestran actividad de la enfermedad On-Tx frente a los pacientes que no muestran actividad de la enfermedad en el Tx. Tal hallazgo puede ayudar a identificar a los pacientes para quienes la teriflunomida es el DMT óptimo. En segundo lugar, el tratamiento con teriflunomida puede alterar la expresión de una o más moléculas de activación de células T en uno o más subgrupos de T y esta alteración puede correlacionarse con una actividad reducida de la enfermedad, lo que sugiere que la activación alterada de las células T contribuye a una respuesta positiva a la teriflunomida. . En tercer lugar, los cultivos a corto plazo de muestras de referencia frente a muestras de un año de pacientes y de HC de la misma edad pueden identificar diferencias en la cinética de ARNm y proteína de un marcador de activación de células T en pacientes en la línea de base, que luego vuelven a un patrón normal en aquellos sin actividad de la enfermedad al año. Dichos hallazgos apuntarían hacia importantes alteraciones funcionales mediadas por teriflunomida que se correlacionan con una respuesta terapéutica positiva.

F. LUGARES DE ESTUDIO Todos los pacientes serán reclutados de las Clínicas de EM del Hospital Neurológico de Montreal y todo el trabajo experimental se realizará en el Edificio Médico Duff, Departamento de Patología, Universidad McGill.

G. PLAZOS G.1. First Patient In (FPI) - un mes después de la firma del contrato y aprobación ética.

G.2. Último paciente en (LPI) ~ 12-15 meses después de la firma del contrato y la aprobación ética: esto refleja el tiempo requerido para reclutar un total de hasta 75 pacientes tratados con Teriflunomida.

G.3. Análisis intermedios

• Evaluar la tasa de reclutamiento a los 2 meses para considerar la inclusión de centros satélite.
• Análisis RT-PCR de TOB1 en 5-10 pacientes Pre-TX y HC apareados por edad (4 meses).
• Análisis preliminar de citometría de flujo de biomarcadores de proteínas de superficie basado en la identificación tentativa de ~ 3 pacientes activos frente a ~ 3 estables identificados en el punto de tiempo On-Tx de 8 meses
• Análisis de citometría de flujo adicional de biomarcadores de proteínas de superficie en otros 3 pacientes activos frente a 3 estables identificados en el punto temporal de 14 meses en el Tx.

G4. Reporte de progreso. Actualizaciones de progreso trimestrales sobre el reclutamiento de pacientes e informe semestral sobre parámetros de evaluación clínica para subgrupos de pacientes.

G5. Última visita del paciente (LPLV) - 24-27 meses. G6. Finalización del Informe Final - 30 meses. G7. Envío de Manuscrito Proyectado. 33 meses H. ANEXOS ANEXO 1. Panel de anticuerpos primarios

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (Sistema de I+D)
7. TLR2 PE (biociencia electrónica)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (biociencia electrónica)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (a veces abreviado). AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ APÉNDICE 2. Paneles de ensayo de ARN PrimeFlow™ que incluyen TLR2 como posible biomarcador - en desarrollo