Biomarkery a aktivita onemocnění u pacientů léčených teriflunomidem (Aubagio)

NÁZEV: Asociace možných biomarkerů s aktivitou onemocnění u pacientů léčených teriflunomidem (Aubagio ®)

A. STAV TECHNIKY Teriflunomid (Aubagio) je perorální imunomodulační DMT podávaná jednou denně pro pacienty s relabující-remitující RS (RRMS) (1). Cílem této studie je určit, zda předpokládaný biomarker předpovídá aktivitu onemocnění u pacientů léčených teriflunomidem. Výzkumníci dříve identifikovali 130genový podpis spojený s imunitní aktivací, který identifikoval pacienty s RS, kteří měli rychlý přechod do sekundární progresivní RS (SPMS). Z tohoto podpisu vědci identifikovali tři geny (TLR2, TLR4 a CCR1), které měly u těchto pacientů zvýšenou expresi proteinu na naivních CD4 T-buňkách. Výzkumníci také ukázali, že mRNA pro antiproliferační faktor, nazývaný TOB1, byla v těchto T-buňkách u pacientů s rychlou progresí MS downregulována. Zjištění proto naznačují, že aktivace naivních CD4 T-buněk identifikuje pacienty s RS s krátkým trváním RRMS (2).

Pro tento návrh hlavní výzkumník navrhuje, že různé molekuly zapojené do aktivace T-buněk mohou také sloužit jako užitečné biomarkery k predikci léčebných odpovědí na teriflunomid.

B. STUDIJNÍ CÍLE

B1. Cíl studia a specifické cíle. Cílem je určit, zda markery aktivace T-buněk, které byly dříve identifikovány, budou předpovídat aktivitu onemocnění u pacientů léčených teriflunomidem.

Konkrétní cíle studie jsou určit:

1. podíl pacientů před léčbou (pre-Tx), kteří mají změněnou expresi jednoho nebo více kandidátních markerů v jedné nebo více T-podskupinách;
2. zda se hladiny exprese jednoho nebo více těchto markerů v podskupině T změnily při léčbě (On-Tx) teriflunomidem;
3. zda rozdíly v mRNA nebo proteinové kinetice domnělého markeru předpovídají aktivitu onemocnění u pacientů léčených teriflunomidem;
4. zda hladiny exprese jedné nebo více cílových molekul, Pre-Tx nebo On-Tx, korelují s průkazem aktivity onemocnění po jednom roce léčby.

C. DESIGN STUDIE.

C1. Shrnutí návrhu. Studie je dvouletá prospektivní observační studie pacientů léčených teriflunomidem. Vyšetřovatelé přijmou na začátku až 75 pacientů. Vyšetřovatelé budou studovat pacienty na začátku a v intervalech On-Tx s teriflunomidem, aby identifikovali pacienty s aktivním vs. stabilním onemocněním na základě klinických (relaps) a radiologických (nové hyperintenzivní léze T2) důkazů. Výzkumníci budou studovat expresi biomarkerů v každé podskupině pacientů.

C2. Primární koncové body. Ústřední otázkou studie je, zda se hladiny exprese jednoho nebo více domnělých biomarkerů (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) liší mezi pacienty ze dvou informativních podskupin.

C3. Měření výsledku. Výsledky, které budou řešit hlavní otázku studie, zahrnují následující:

1. Měření hladin proteinové exprese TLR2, TLR4 a CCR1 na CD4 T-podskupinách průtokovou cytometrií.
2. Exprese mRNA TOB1 v CD4 T-podskupinách pomocí kvantitativní RT-PCR (qRT-PCR) a PrimeFlow RNA Assay.
3. Rozdíly v expresi mRNA nebo proteinů vybraných markerů v krátkodobých kulturách mezi pacienty ze dvou informativních podskupin.

C4. Subjektová populace. Studijní populace zahrnuje:

1. dosud neléčení pacienti s RRMS z klinik RS Montreal Neurological Hospital (MNH) před léčbou (pre-Tx) teriflunomidem; a
2. pacientů s RRMS, kteří byli dříve léčeni jinými terapiemi modifikujícími onemocnění (DMT), ale kteří přecházejí na teriflunomid.

C5. Etické schválení: Studie byla schválena Etickou radou pro výzkum neurověd MNH/MN. Údaje budou uchovávány po dobu 7 let.

C6. Souhlasy. Hlavní zkoušející nebo jeho zástupce obdrží informovaný souhlas

D. STUDIJNÍ POSTUPY. Studie bude zkoumat podpis biomarkerů u pacientů s RS, kteří jsou léčeni teriflunomidem svým neurologem.

D1. Účastníci a návštěvy kliniky. Před zahájením léčby teriflunomidem podstoupí každý pacient klinické vyšetření, MRI jako součást běžné klinické praxe a odběr krve (viz níže). V určitých intervalech budou účastníci absolvovat klinické hodnocení a druhé hodnocení MRI, aby se zjistilo, zda mají aktivní nebo stabilní onemocnění. Aby byl umožněn fázový přístup, neurologové se budou snažit identifikovat pacienty po šesti měsících léčby, kteří vykazují známky aktivní vs. stabilní nemoci, přibližně 3 v každé podskupině. Od každého z těchto pacientů budou odebrány vzorky krve pro následné laboratorní studie (viz níže).

D2. Kolekce vzorků. Každému subjektu bude na začátku a v intervalech odebráno až 120 ml periferní žilní krve za účelem odběru séra a plazmy, získání celkového počtu lymfocytů, počtu CD3, CD4 a CD8 a okamžité izolace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC). analýzy a také pro kryoprezervaci.

D3. Laboratorní rozbor.

D3.1. Izolace naivních CD4 T-buněk a kvantitativní RT-PCR analýza exprese TOB1. Snížená exprese TOB1, inhibitoru proliferace T-buněk, korelovala s rychlou progresí z CIS do RRMS v jedné studii (2) a také korelovala v předchozí studii výzkumníků s rychlou progresí z RRMS do SPMS (2). Vyšetřovatelé izolují naivní CD4 T-buňky pomocí kuliček MACS (2) a stanoví expresi TOB1 pomocí kvantitativní RT-PCR u malé skupiny pacientů (5–10 pacientů) a zdravých kontrol (HC) stejného věku.

D3.2. Analýza kryokonzervovaných PBMC.

Strategie 1. Exprese povrchových proteinů TLR2, TLR4 a CCR1 v CD4 T-podskupinách. Vyšetřovatelé budou analyzovat základní a kryokonzervované vzorky On-Tx na expresi (% pozitivity a MFI) TLR2, TLR4 a CCR1 na naivních, centrální paměti, efektorové paměti, terminálně diferencované efektorové paměti a regulačních T-buňkách průtokovou cytometrií na BD LSRFortessa s 5-laserovým systémem. Vyšetřovatelé použijí pro analýzu software FlowJo. Výzkumníci identifikují biomarker, který je nejvíce informativní, tj. vykazuje největší rozdíl v hladinách exprese mezi pacienty ve dvou informativních podskupinách na začátku nebo při léčbě.

Strategie 2. Srovnání exprese TOB1 mRNA pomocí qRT-PCR a PrimeFlow RNA Assay. Výzkumníci vyvinou test PrimeFlow™ RNA (affymetrix Ebioscience) pro současnou analýzu exprese mRNA a proteinů. Zpočátku budou výzkumníci porovnávat expresi mRNA TOB1 s expresí získanou pomocí qRT-PCR, protože qRT-PCR je zlatým standardem pro kvantifikaci mRNA. Výzkumníci budou porovnávat expresi TOB1 mRNA v naivních CD4 T-buňkách dvěma metodami. Pokud budou měření srovnatelná, budou pak vyšetřovatelé schopni současně posoudit expresi TOB1 v naivních CD4 T-buňkách a expresi nejinformativnějšího biomarkeru v CD4 T-podskupinách a porovnat hladiny exprese u pacientů ze dvou informativních podskupin, jak je uvedeno níže. .

Strategie 3. mRNA a proteinová kinetika TOB1 a biomarker T-buněk ve stimulovaných T-buňkách. Vyšetřovatelé předpokládají, že stimulace T-buněk identifikuje rozdíly mezi pacienty ze dvou informativních podskupin buď v mRNA, nebo v kinetice proteinů TOB1 nebo jednoho z našich biomarkerů povrchových proteinů. Jinými slovy, tyto studie mohou ukázat rozdíly mezi pacienty s aktivní a stabilní RS.

Tato strategie zahrnuje stimulační fázi a analytickou fázi následovně.

1. Za prvé, po výběru pacientů ze dvou podskupin pacientů (3–4 pacienti/podskupina) a z HC odpovídajících věku, budou vyšetřovatelé stimulovat kryokonzervované PBMC z výchozích a jednoletých vzorků léčby pomocí PMA/ionomycinu a inhibitoru transportu proteinů BD GolgiStop™ po dobu 4 hodin při 37 °C v 5% CO2. Vyšetřovatelé určí optimální koncentrace každého činidla prostřednictvím titrace specifické pro daný test pro použití s ​​PrimeFlow RNA Assay.
2. Druhá fáze bude využívat PrimeFlow RNA Assay k hodnocení mRNA a kinetiky proteinů TOB1 a nejinformativnějšího biomarkeru povrchového proteinu v podskupinách pacientů a HC. Tento test může odhalit dynamiku exprese RNA i proteinu v jednotlivých buňkách a v podskupinách T v reakci na stimulaci T-buněk. Užitečnost testu PrimeFlow RNA byla ověřena v orientační studii T-podskupin (4); podrobné metody jsou k dispozici na následující webové stránce: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Statistická analýza. Vyšetřovatelé použijí GraphPad Prism 7 pro všechny statistické analýzy a použijí vhodné parametrické nebo neparametrické testy podle rozložení dat.

E. OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY. Za prvé, vyšetřovatelé předpokládají, že jedna nebo více T-podskupin ve vzorcích PBMC (před léčbou teriflunomidem) bude vykazovat zvýšenou expresi povrchového proteinu jedné nebo více aktivačních molekul T-buněk u pacientů, kteří vykazují aktivitu onemocnění On-Tx vs. nevykazují aktivitu onemocnění On-Tx. Takové zjištění může pomoci identifikovat pacienty, pro které je teriflunomid optimální DMT. Za druhé, léčba teriflunomidem může změnit expresi jedné nebo více aktivačních molekul T-buněk v jedné nebo více podskupinách T a tato změna může korelovat se sníženou aktivitou onemocnění, což naznačuje, že změněná aktivace T-buněk přispívá k pozitivní reakci na teriflunomid . Za třetí, krátkodobé kultivace výchozích vzorků vs. jednoroční vzorky od pacientů a od HC odpovídajícího věku mohou identifikovat rozdíly v mRNA a kinetice proteinů markeru aktivace T-buněk u pacientů na začátku, které se pak vrátí k normálnímu vzoru ti, kteří po jednom roce nevykazují žádnou aktivitu onemocnění. Taková zjištění by poukazovala na důležité funkční změny zprostředkované teriflunomidem, které korelují s pozitivní terapeutickou odpovědí.

F. STUDIJNÍ MÍSTA Všichni pacienti budou rekrutováni z klinik neurologické nemocnice v Montrealu a veškerá experimentální práce bude probíhat v Duff Medical Building, Ústav patologie, McGill University.

G. ČASOVÉ LHŮTY G.1. First Patient In (FPI) – jeden měsíc po uzavření smlouvy a etickém schválení.

G.2. Last Patient In (LPI) ~ 12-15 měsíců po uzavření smlouvy a etickém schválení: to odráží čas potřebný k náboru celkem až 75 pacientů léčených Teriflunomidem.

G.3. Průběžné analýzy

• Posuďte míru náboru po 2 měsících, abyste zvážili zahrnutí satelitních center.
• RT-PCR analýza TOB1 u 5-10 pacientů Pre-TX a HC odpovídající věku (4 měsíce).
• Předběžná průtoková cytometrická analýza biomarkerů povrchových proteinů založená na předběžné identifikaci ~ 3 aktivních vs. ~ 3 stabilních pacientů identifikovaných v 8měsíčním časovém bodě On-Tx
• Další analýza biomarkerů povrchových proteinů průtokovou cytometrií u dalších 3 aktivních vs. 3 stabilních pacientů identifikovaných v časovém bodě 14 měsíců On-Tx.

G4. Zprávy o pokroku. Čtvrtletní aktualizace pokroku v náboru pacientů a půlroční zpráva o parametrech klinického hodnocení pro podskupinu pacientů.

G5. Poslední návštěva pacienta (LPLV) - 24-27 měsíců. G6. Vypracování závěrečné zprávy - 30 měsíců. G7. Předpokládané odevzdání rukopisu. 33 měsíců. H. PŘÍLOHY PŘÍLOHA 1. Panel primárních protilátek

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (R&D Sys.)
7. TLR2 PE (eBioscience)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBioscience)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (někdy zkráceně. AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ PŘÍLOHA 2. Panely PrimeFlow™ RNA Assay včetně TLR2 jako možného biomarkeru – ve vývoji